沈秋蓮，葉財發(fā)，倪曉霞，陳錦珊

0 引 言

10%水楊酸軟膏為《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》(以下簡稱《軍隊制劑規(guī)范》)2015年版(第一冊)收載的標準制劑[1]，臨床用于治療皮脂溢出、脂溢性皮炎、銀屑病、淺部真菌病、趾疣、雞眼及局部角質(zhì)增生。《中國藥典》2015年版僅收載2%、5%水楊酸軟膏，《軍隊制劑規(guī)范》雖然收載有10%水楊酸軟膏，但未明確其微生物限度檢查的具體方法，經(jīng)文獻查新亦未見相關(guān)報道。鑒于10%水楊酸軟膏配制過程中容易引入微生物等污染源，因此加強質(zhì)量控制至關(guān)重要。為此，筆者以《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106及1107檢測規(guī)則為依據(jù)，通過考察供試液的稀釋劑、稀釋級及pH等因素，同時對10%水楊酸軟膏進行處理以消除其抗菌性[2-3]，最終建立微生物限度檢查方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器HH-W21-420電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)、KQ-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、LDZH-150KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、LRHS-400-Ⅲ恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)、HWS-400型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)、78-1磁力加熱攪拌器(金壇市科析儀器有限公司)、PHS-3C酸度計(杭州雷磁有限公司)。

1.1.2 試藥水楊酸軟膏(批號：201903211、201903212、201903213，規(guī)格20 g∶2 g，聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院自制)。

1.1.3 稀釋液與試劑0.9%氯化鈉注射液(批號：20191113，聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院自制)，pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：1071461，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，肉豆蔻酸異丙酯(批號：201908071，成都艾科達化學(xué)試劑有限公司)、二甲基亞砜(批號：180728，浙江杭州雙林化工試劑廠)，均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1082461)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1081801)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：1082451)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：3106032)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：1082132)、溴代十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1073801)，以上均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.5 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonaaeruginosa )[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63 501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]及黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98 003](以上均來源于中國食品藥品檢定研究院，且均為3代)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備取經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各1 mL和經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基1 mL，分別用兩種稀釋劑(0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)制成每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液[3-6]。

取經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，分別加入3～5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的兩種稀釋劑。將孢子洗脫，再用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，分別用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的兩種稀釋劑制成每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液[3-6]。

1.2.2 供試液制備稱取供試品20 g，加至含20 mL肉豆蔻酸異丙酯、20 mL二甲基亞砜和玻璃珠的無菌三角燒瓶中，再分別加入0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，振搖，45 ℃水浴超聲30 min充分混勻后靜置，取水層作為1∶10供試液。從1∶10供試液中取50 mL、20 mL、10 mL，分別加入0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，作為1∶20、1∶50、1∶100供試液。

1.2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗(1)以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑，采用常規(guī)法[7-8]進行微生物計數(shù)適用性試驗：①試驗組：取制備好的供試液9.9 mL，加入試驗菌菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供試液1 mL，注入平皿中，立即傾注培養(yǎng)基(需氧菌總數(shù)測定用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌總數(shù)測定用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，每個菌株平行制備2個平皿，點計菌落數(shù)。②菌液組：用稀釋劑代替供試液，按“試驗組”的操作加入試驗菌液，點計菌落數(shù)。③供試品對照組：吸取上述制備好的供試液1 mL，用稀釋劑代替菌液，其余操作同“試驗組”，測定供試品的本底菌數(shù)。 ④陰性對照組：用稀釋劑代替供試液和菌液，其余操作同“試驗組”，以測定稀釋劑的本底菌數(shù)。(2)以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑，采用培養(yǎng)基稀釋法[9-10]進行微生物計數(shù)適用性試驗:試驗組：取制備好的供試液9.9 mL，加入試驗菌菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供試液0.2 mL，注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，每個菌株平行制備10個平皿，點計菌落數(shù)。供試品對照組、菌液組及陰性對照組同“常規(guī)法”操作，測定菌落數(shù)，計算回收率。(3)以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，采用常規(guī)法進行微生物計數(shù)適用性試驗:用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替0.9%氯化鈉注射液，試驗組、供試品對照組、菌液組及陰性對照組同“常規(guī)法”操作。

1.2.4 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜的抗菌性考察按“1.2.2”項下要求制備供試液，分別在含有80 mL0.9%氯化鈉注射液和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的無菌三角燒瓶中加入10 mL10%肉豆蔻酸異丙酯和10 mL10%二甲基亞砜，振搖混勻，即得1∶10供試液。用上述供試液，采用常規(guī)法進行微生物計數(shù)方法試驗，以5種常用菌作為試驗菌用常規(guī)法考察肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜對抗菌活性的影響。

1.2.5 控制菌方法適用性試驗分別取“1.2.2”項下制備好的1∶10供試液10 mL和“1.2.1”項下制備好的金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌菌懸液1 mL(含菌量≤100 cfu)，按《中國藥典》2015年版四部金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌檢查項下進行試驗。

2 結(jié) 果

2.1 供試液酸堿度測定結(jié)果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，1∶10～1∶100各稀釋級供試液pH值在2.30～2.81之間。以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑時，1∶10～1∶100各稀釋級供試液pH值在5.53～6.88之間。見表1。

表1 兩種稀釋劑下各稀釋級供試液的pH值

2.2 微生物計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，分別取1∶10～1∶100供試液，采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法對水楊酸軟膏進行微生物計數(shù)方法試驗顯示，5種試驗菌種的回收率均低于0.5，不符合《中國藥典》2015年版四部通則要求, 見表2、表3。pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑常規(guī)法試驗顯示，5種試驗菌種的回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求，見表4。故以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，取1∶10供試液1 mL，采用常規(guī)法可作為水楊酸軟膏的微生物計數(shù)方法。

表2 0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑常規(guī)法試驗回收率(n=3)

2.3 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜的抗菌性考察結(jié)果5種試驗菌種的回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求。故可以用10%肉豆蔻酸異丙酯和10%二甲基亞砜作為增溶劑。見表5。

表3 0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑培養(yǎng)基稀釋法試驗回收率(n=3)

表4 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑常規(guī)法試驗結(jié)果(1∶10供試液，n=3)

表5 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜在兩種稀釋劑下的試驗回收率(n=3)

2.4 控制菌方法適用性試驗結(jié)果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，試驗組、供試品對照組及陰性對照組無菌落生長，菌液組有典型菌落生長，表明供試液對控制菌生長有抑制作用。以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑時，試驗組、菌液組有典型菌落生長，供試品對照組及陰性對照組無菌落生長，表明供試液對控制菌生長無抑制作用。因此，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則1106控制菌檢查要求，宜選用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，并采用常規(guī)法用于控制菌檢查。見表6。

表6 控制菌驗證結(jié)果(n=3)

3 討 論

3.1 開展本試驗研究的必要性現(xiàn)行的《中國藥典》和《軍隊制劑規(guī)范》均無10%水楊酸軟膏微生物限度檢查方法，亦未見相關(guān)研究報道，因此進行試驗研究及方法學(xué)驗證對保證其質(zhì)量具有重要意義。

3.2 供試液制備增溶劑的選擇水楊酸軟膏由水楊酸、羊毛脂、黃凡士林等配制而成[1]。水楊酸是一種脂溶性的有機酸[11]，具有部分酸的通性，在水中的溶解性較差，而黃凡士林的熔點為45～60 ℃[12]，具有一定的拉絲性，因此供試液制備時必須遴選適宜的增溶劑。經(jīng)試驗，我們采取加入10%肉豆蔻酸異丙酯和10%二甲基亞砜置于45 ℃水浴超聲30 min，發(fā)現(xiàn)其不但沒有影響微生物生長繁殖，還明顯提高了水楊酸軟膏的溶解性。其中，肉豆蔻酸異丙酯具有良好的溶解、潤滑、促透作用，還具有一定的自乳化作用，而二甲基亞砜具有強極性、脂水雙親性及其在液態(tài)所處溫度范圍廣等特性，是兼容有機物和無機物的萬能溶劑，兩者對難溶性或脂溶性藥物具有增溶作用[13-14]。

3.3 供試液pH值對抗菌活性的影響pH值與微生物生長代謝密切相關(guān)，不同微生物有不同的適宜pH值，可根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH值以適應(yīng)不同微生物生長需求[15]。對好氧微生物而言，pH值維持在5～9最優(yōu)。前期我們選用0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，制備所得1∶10～1∶100供試液pH值在2.30～2.81之間，采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法5種試驗菌株的回收率均低于0.5，推測強酸環(huán)境是導(dǎo)致試驗菌株不生長的主要原因。后期我們改用具有pH緩沖作用的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，制備所得1∶10～1∶100供試液pH值在5.53～6.88之間，采用常規(guī)法5種試驗菌株的回收率均在0.5～2的標準范圍內(nèi)，而且很好地去除了水楊酸軟膏的抑菌性。

綜上所述，經(jīng)驗證，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，采用常規(guī)法可作為10%水楊酸軟膏的微生物限度檢查方法。