李 婧，張玫瑰，白仲添

(蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000)

無限增殖及強(qiáng)DNA合成能力是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，其對(duì)高強(qiáng)度DNA復(fù)制壓力下的基因組的穩(wěn)定性維持尤為需要。脫氧核苷三磷酸池(deoxyribonucleoside triphosphate pool， dNTP)的平衡是DNA正確復(fù)制和修復(fù)的必要條件，其失衡會(huì)增強(qiáng)誘變作用，誘導(dǎo)基因重組、染色體異常、DNA斷裂和細(xì)胞死亡[1]。闡明腫瘤細(xì)胞增殖過程中dNTP池的穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，有望為靶向治療藥物研發(fā)提供新策略。三磷酸脫氧胞苷焦磷酸酶1(dCTP pyrophosphatase 1, DCTPP1)在腫瘤細(xì)胞dNTP池的平衡調(diào)節(jié)中的作用已經(jīng)引起了研究者的注意，同時(shí)它亦參與調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程及耐藥性產(chǎn)生。因此，本文對(duì)DCTPP1在腫瘤細(xì)胞中的功能進(jìn)行總結(jié)分析，以期為DCTPP1作為腫瘤藥物靶點(diǎn)及調(diào)節(jié)耐藥方面的深入研究提供思路。

1 DCTPP1的結(jié)構(gòu)及定位

DCTPP1屬于核苷三磷酸焦磷酸酶(NTP-PPase)超家族。在所有脊椎動(dòng)物、綠色植物、單曲霉菌和赤霉菌中均檢測(cè)到高度保守的DCTPP1直系同源物[2-3]，這種進(jìn)化過程中的保守性提示著它在生命過程中的重要性。

DCTPP1的單體結(jié)構(gòu)由4個(gè)α螺旋組成(α1、α2、α3和α4)，最終由兩個(gè)二聚體通過α2和α3螺旋的17對(duì)疏水殘基相互作用形成四聚體，α3和α4之間有一個(gè)Mg2+的結(jié)合殘基[2]。

NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄微陣列分析和SAGE數(shù)據(jù)表明，DCTPP1在肝、腎、卵巢和睪丸的胚胎和增殖細(xì)胞中高度表達(dá)，廣泛存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。但是，在穩(wěn)定細(xì)胞中DCTPP1主要分布于線粒體內(nèi)。

2 DCTPP1與腫瘤細(xì)胞中的核苷酸代謝

2.1 在dCTP代謝中的核心作用

DCTPP1在三磷酸脫氧胞苷(dCTP)的平衡和修飾性脫氧胞苷的代謝中起著核心作用。DCTPP1作為dCTP焦磷酸酶，具有水解dCTP為相應(yīng)的脫氧胞苷單磷酸(dCMP)和焦磷酸(PPi)的基本功能，反應(yīng)終產(chǎn)物反向調(diào)節(jié)DCTPP1水平。人成纖維細(xì)胞MRC-5 和人宮頸癌細(xì)胞HeLa中下調(diào)DCTPP1后，細(xì)胞內(nèi)dCTP增加，同時(shí)對(duì)核苷類似物5-甲基-2′-脫氧胞苷(5-Me-2′-dC)和5-碘-2′-脫氧胞苷(5-I-2′-dC)的敏感性增強(qiáng)，提示DCTPP1能夠削弱修飾性脫氧胞苷的毒性作用[4]，即DCTPP1抑制劑可增加核苷類似物的細(xì)胞毒性作用。但是，在人慢性粒細(xì)胞白血病HAP1中，DCTPP1敲除并未發(fā)現(xiàn)dCTP積累增多[5]，提示DCTPP1并不是調(diào)控dCTP的唯一酶類。DCTPP1缺失的情況下，CTP合成酶、脫氧胞苷激酶dCK、SAMHD1、AK9等也參與了dCTP水平的調(diào)控[6-7]。

胞嘧啶甲基化形式是調(diào)控高等脊椎動(dòng)物基因正確表達(dá)的關(guān)鍵，基因組甲基化與腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子的異常激活或抑癌基因的異常失活有關(guān)。DCTPP1對(duì)5-甲?；?dCTP、5-甲基-dCTP和5-鹵代-dCTP等修飾性dCTP有高度的水解活性[4]，以保護(hù)新合成的DNA不被表觀修飾后的胞嘧啶摻入。5-氯-dCTP有助于甲基化敏感的DNA結(jié)合蛋白與DNA結(jié)合，也可以將人類甲基化酶錯(cuò)誤地定向到未甲基化的CpG位點(diǎn)，DCTPP1通過降解5-氯-dCTP阻止了蛋白-DNA復(fù)合物形成導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂以及CpG島的甲基化，從而在DNA修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。

2.2 維持dTTP和dUTP穩(wěn)態(tài)

DCTPP1還參與了其他嘧啶核苷酸的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞中缺失DCTPP1可引起dTTP的合成減少以及dUTP的增加，使得三磷酸脫氧尿嘧啶/三磷酸脫氧胸腺嘧啶(dUTP/dTTP)比值增大[9]。一方面，高度增殖的細(xì)胞具有強(qiáng)的核苷酸從頭合成能力。而DCTPP1對(duì)dTTP的從頭合成至關(guān)重要，尤其在缺乏dCTP或dTTP的情況下。DCTPP1水解dCTP生成dCMP，而后被dCMP脫氨酶(deoxycytidine monophosphate deaminase, dCMP deaminase)脫氨生成脫氧尿苷單磷酸(dUMP)，在胸苷酸合成酶(TS)的作用下轉(zhuǎn)化為脫氧胸苷單磷酸(dTMP)，經(jīng)胸腺核苷酸激酶(thymidylate kinase,TMPK)和核苷二磷酸激酶(nucleotide diphosphate kinase, NDK)磷酸化，最終合成dTTP。缺乏DCTPP1時(shí)，細(xì)胞高度依賴于dTTP的挽救合成[5]。另一方面，缺失DCTPP1可導(dǎo)致細(xì)胞易于積累尿嘧啶(dUTP)，DCTPP1可消除過量的dUTP防止尿嘧啶摻入DNA代替胸腺嘧啶。大多數(shù)DNA聚合酶無法區(qū)分胸腺嘧啶和尿嘧啶，dUTP和dTTP的相對(duì)水平成為dUTP是否摻入DNA的主要影響因素。當(dāng)尿嘧啶摻入DNA鏈后，細(xì)胞通過簡單的修復(fù)途徑來切除錯(cuò)誤摻入的尿嘧啶。尿嘧啶-DNA糖基化酶可識(shí)別并去除尿嘧啶，保留無堿基位點(diǎn)， dAMP和dCMP可優(yōu)先摻入這些無堿基位點(diǎn)，因此尿嘧啶的消除具有潛在的誘變作用。此外，在維持高dUTP/dTTP比的細(xì)胞中，修復(fù)過程中依舊會(huì)摻入dUTP，這將產(chǎn)生無用的切割和合成循環(huán)，最終由于發(fā)夾塌陷而導(dǎo)致 DNA鏈斷裂。這種因尿嘧啶(dUTP)積累引起的DNA雙鏈斷裂表現(xiàn)為以持久性γ鏈斷裂為特征的廣泛性基因組損傷[9]。因此，DCTPP1在維持細(xì)胞dNTP池的平衡及保持基因組穩(wěn)定性過程中具有重要的調(diào)控作用。

3 DCTPP1與腫瘤

3.1 DCTPP1與腫瘤細(xì)胞惡性表型

DCTPP1在乳腺癌[6]、胃癌[8]、前列腺癌[10-11]、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[12]和神經(jīng)母細(xì)胞瘤[13]等多種腫瘤中高表達(dá)。與配對(duì)的癌旁組織相比，DCTPP1在癌細(xì)胞的核蓄積現(xiàn)象尤為明顯，且與組織學(xué)分型相關(guān)：與胃管狀腺癌/鱗癌、食管鱗癌/小細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌/肺鱗癌相比，胃癌印戒細(xì)胞癌/未分化癌、食管腺癌、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞核中DCTPP1富集度更高[14]。DCTPP1表達(dá)水平升高與各種癌的不良預(yù)后相關(guān)。乳腺癌、前列腺中DCTPP1的上調(diào)與癌的復(fù)發(fā)率低、總生存期呈負(fù)相關(guān)，且與更高的腫瘤分期和分級(jí)相關(guān)[10]。胃癌中DCTPP1的高表達(dá)與浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及癌進(jìn)程顯著相關(guān)[8]。

DCTPP1表達(dá)水平下調(diào)，尤其是缺乏dCTP或dTTP的情況下會(huì)可阻滯癌細(xì)胞增殖。一方面，高度增殖的腫瘤細(xì)胞需要招募大量的DNA合成前體，此過程離不開DCTPP1對(duì)dNTP池穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)；另一方面，DCTPP1是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)劑，激活的DCTPP1可阻滯Wnt信號(hào)通路中β-catenin的磷酸化和降解，從而穩(wěn)定地將后者轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活Wnt信號(hào)靶基因，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[15]。此外，DCTPP1的過表達(dá)使癌細(xì)胞獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力[16]。此外，DCTPP1敲低的腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期發(fā)生G1-S期阻滯，DNA的合成受阻[9]，在多種癌干細(xì)胞中DCTPP1表達(dá)上調(diào)，提示DCTPP1可能參與細(xì)胞周期調(diào)控，是腫瘤干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物。

3.2 DCTPP1與腫瘤治療

細(xì)胞毒性核苷酸類似物是臨床上重要的抗癌藥物，其作用機(jī)制之一是通過與八種基本核苷酸競爭胞內(nèi)靶點(diǎn)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性[17]。然而，此類藥物由于強(qiáng)的副作用和原發(fā)性/獲得性耐藥，在臨床應(yīng)用中具有明顯缺陷。因此，開發(fā)強(qiáng)靶向性抗核苷代謝藥物勢(shì)在必行。另外，將靶向性強(qiáng)的核苷酸代謝的酶作為靶標(biāo)，并聯(lián)合經(jīng)典的化療方案，可能產(chǎn)生協(xié)同抗癌效應(yīng)，這將為腫瘤治療策略的制定提供新思路[16]。

DCTPP1作為調(diào)節(jié)dCTP的核心代謝酶受到了越來越多研究者的關(guān)注，目前已發(fā)現(xiàn)DCTPP1參與多種腫瘤的耐藥。胞苷類似物地西他濱是DNA脫甲基和遺傳毒性藥物，DCTPP1通過從核苷酸池中清除5-氮雜-dCTP來抵消抗地西他濱的細(xì)胞毒性作用[18]。一方面，DCTPP1可以水解地西他濱的活化形式并且調(diào)節(jié)地西他濱誘導(dǎo)的DNA低甲基化；另一方面，DCTPP1缺陷細(xì)胞在其核苷酸池和基因組DNA中均表現(xiàn)出dUTP積累，最終導(dǎo)致dUTP在細(xì)胞庫中的遺傳毒性積累[9,19]。這也許意味著地西他濱與DCTPP1抑制劑的聯(lián)合使用可以預(yù)防腫瘤細(xì)胞耐藥。DCTPP1可降低人胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性[20]，其通過耐藥基因MDR 1的高表達(dá)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的上調(diào)來阻止細(xì)胞將5-Fu轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，增加5-Fu的胞內(nèi)蓄積，提高胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。同樣，缺乏DCTPP1的腫瘤細(xì)胞對(duì)-5-氟-2-脫氧尿苷(5-F-2-dUrd)的敏感性較高，且在dUTP/dTTP比率高的細(xì)胞中尤為敏感。提示DCTPP1在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)可能是一種新的耐藥機(jī)制，開發(fā)DCTPP1抑制劑有望提高核苷酸類似物的藥效。

已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了特異性抑制DCTPP1的活性分子，這些化學(xué)抑制劑可增強(qiáng)嘧啶核苷酸類似物的細(xì)胞毒性作用。天然產(chǎn)物雷公藤內(nèi)酯是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的DCTPP1抑制劑，可以直接與DCTPP1結(jié)合[21]。哌嗪-1-基吡啶嗪類化合物對(duì)DCTPP1表現(xiàn)出優(yōu)越的的親和能力，吡啶酮和嘧啶酮衍生物、3,6-二取代三氮唑、吡咯香豆素、苯并咪唑衍生物等也顯示出了對(duì)DCTPP1良好的抑制性能[22]。對(duì)于DCTPP1抑制劑的細(xì)胞毒性及其與DNA合成途徑中的其他因子的作用有待進(jìn)一步研究。

4 問題與展望

細(xì)胞DNA的活躍復(fù)制是維持腫瘤異常增殖的基礎(chǔ)，DNA合成相關(guān)靶向治療也因此被視為最有前途的抗癌策略。但目前臨床批準(zhǔn)使用的藥物由于毒副作用強(qiáng)、靶點(diǎn)特異性差，使針對(duì)DNA合成的抑制劑在腫瘤臨床治療中的效果令人不滿。腫瘤細(xì)胞高強(qiáng)度DNA復(fù)制壓力可異常激活染色體脆性位點(diǎn)(common fragile sites, CFSs)，使DNA復(fù)制不僅發(fā)生于G0/G1期，還可在M期進(jìn)行，以維持基因組穩(wěn)定性及質(zhì)量，這是腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制的獨(dú)有特征及缺陷。若能找到協(xié)調(diào)DNA復(fù)制壓力的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可徹底削弱腫瘤細(xì)胞DNA穩(wěn)定性，繼而從根本上抑制增殖。基于特異性靶向腫瘤細(xì)胞DNA合成的動(dòng)態(tài)新療法可能最有希望改善癌癥治療結(jié)局，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期特異性多靶點(diǎn)抑制劑的研發(fā)為腫瘤的臨床治療重建了希望。值得注意的是，DCTPP1對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥的促進(jìn)作用以及DCTPP1抑制劑對(duì)嘧啶類核苷酸類似物的增敏效應(yīng)，有望使其成為腫瘤分子靶向治療的新靶點(diǎn)。