馬鴻倩 鄢和新

當(dāng)肝臟受到致病因素(代謝、酒精、病毒、遺傳性、癌癥、免疫、毒性或藥物相關(guān))損害時(shí)，導(dǎo)致肝功能不全，發(fā)生不可修復(fù)的器官損傷，甚至危及生命。原位肝移植(OLT) 是治療肝衰竭唯一有效的方法，但供肝數(shù)量有限限制了肝移植的應(yīng)用。此外，移植后的終身免疫抑制治療會(huì)增加感染、惡性腫瘤和其他不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

人工肝系統(tǒng)可以作為OLT的一種有效過渡替代治療，然而，該系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)肝臟代謝功能以及患者血漿中重要的生物活性物質(zhì)被吸附清除這兩個(gè)缺陷限制了它的長期使用。目前正在開發(fā)的生物人工肝(BALs)是指在生物反應(yīng)器中加入肝細(xì)胞來模擬人體正常肝臟，從而代替受損肝臟發(fā)揮解毒、合成和生物轉(zhuǎn)化等功能的一種體外肝功能支持系統(tǒng)，在肝病患者的臨床治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。

肝細(xì)胞移植也可以替代OLT用于肝臟疾病的治療，特別是當(dāng)僅有肝功能缺陷而器官的結(jié)構(gòu)未受到影響時(shí)(例如某些單基因遺傳病)，或者作為肝移植等待期的橋梁。然而肝病的細(xì)胞療法目前也存在許多問題亟待解決。

一、hPSC可為肝細(xì)胞應(yīng)用提供新的細(xì)胞來源

PHHs是肝細(xì)胞治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但其供應(yīng)不足、成本高、增殖能力低、代謝活性喪失快，限制了它們?cè)隗w外的應(yīng)用。使用人胚胎干細(xì)胞(hESCs)作為細(xì)胞治療的來源會(huì)受到倫理問題的限制。2007年，山中伸彌[1]將人類成體細(xì)胞重編程得到了一種類似于hESCs的細(xì)胞，即人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)。之后，更多的研究發(fā)現(xiàn)，可以使用不同的重編程技術(shù)和體細(xì)胞類型來獲得hiPSCs。hiPSCs的分化方法為肝臟疾病的研究和治療提供了無限的肝細(xì)胞來源[2]。盡管多能干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞(PSC-HLCs)表型更接近于胎兒肝細(xì)胞，而不是成人肝細(xì)胞[3]，但它們已被有效地用于慢性肝病或急性肝衰竭動(dòng)物模型的移植治療，表明這些細(xì)胞可以在體內(nèi)進(jìn)一步成熟[4]。這說明分化細(xì)胞缺乏成熟度可能不是它們?cè)谝浦仓惺褂玫恼系K。然而藥物篩選、毒理學(xué)研究以及BAL的應(yīng)用都依賴于肝細(xì)胞的功能，因此需要完全成熟的肝細(xì)胞。目前已經(jīng)開發(fā)了新的方法如向培養(yǎng)基中添加小分子、建立共培養(yǎng)模型和三維(3D)培養(yǎng)模型等來提高培養(yǎng)系統(tǒng)中PSC-HLCs的功能。

二、在2D培養(yǎng)系統(tǒng)中促進(jìn)hPSC向肝細(xì)胞分化的研究

(一)小分子化合物 hPSCs的體外培養(yǎng)往往需要加入生長因子或細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的分化，研究發(fā)現(xiàn)一些小分子例如CHIR99021(激活Wnt/β-catenin途徑)和LY294002(PI3K抑制劑)的加入也可以提高分化效率。在內(nèi)胚層分化過程中，添加維甲酸、染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑DMSO或Wnt/β-catenin途徑的Wnt反應(yīng)抑制劑IWR-1也能促進(jìn)hPSCs向肝系的分化?；衔顴(抑制Noch通路)和SB431542(抑制TGFβ通路)可以阻止肝祖細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化，從而有利于肝細(xì)胞的分化。與生長因子相比，這些小分子不容易發(fā)生批次變化，在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)中更容易被接受。

(二)細(xì)胞外基質(zhì) 肝細(xì)胞具有復(fù)雜的極化功能和極強(qiáng)的黏附特性，需要多種因素相互作用才能在體外維持其生理特性和功能，例如肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能依賴于肝細(xì)胞的極化和細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。因此，開發(fā)了人工構(gòu)造(如納米纖維、薄膜或水凝膠)來模仿細(xì)胞微環(huán)境，以增強(qiáng)肝細(xì)胞的黏附、遷移和增殖能力。這些支架通常由膠原、殼聚糖、明膠、海藻酸鹽和瓊脂糖等天然聚合物或聚ε-己內(nèi)酯和聚L-乳酸等合成物制成。

將PHH培養(yǎng)在兩層I型膠原或Matrigel之間，形成的結(jié)構(gòu)與體內(nèi)觀察到的細(xì)胞與細(xì)胞、以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)相似。目前已將該模型應(yīng)用于hESCs，使其能夠更好地分化為最終的內(nèi)胚層，增強(qiáng)HLC的極化功能[5]。

(三)hPSC來源肝細(xì)胞的共培養(yǎng) 單獨(dú)在體外培養(yǎng)PHHs時(shí)其功能會(huì)迅速退化，但它們與間充質(zhì)干細(xì)胞或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)其白蛋白分泌功能和細(xì)胞色素活性顯著提高。因此，在PSCs分化期間，開發(fā)了一系列共培養(yǎng)模型如PSCs與成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的共培養(yǎng)。另外還有研究表明，當(dāng)HLCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共同培養(yǎng)時(shí)，改善HLC特性的主要是共培養(yǎng)培養(yǎng)基而不是HUVECs[6]。

三、hPSC向肝細(xì)胞分化的三維培養(yǎng)系統(tǒng)

(一)三維球體 球狀體是由PHHs、肝源性細(xì)胞系或iPSC-HLCs自聚集產(chǎn)生的，是一種可有或沒有非實(shí)質(zhì)細(xì)胞支持的三維肝臟模型。對(duì)PHHs組成的球狀體模型進(jìn)行測試，確定了防止球體壞死的最大尺寸以及允許培養(yǎng)的最佳細(xì)胞密度等參數(shù)。在3D球體模型中培養(yǎng)PHHs以及hiPSC-HLCs可以延長細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí)間，并保持特異性標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)的活性[7]。

(二)類器官 類器官是一類由干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)形成的，能夠進(jìn)行自我組裝的3D微觀結(jié)構(gòu)，可以模仿器官在體內(nèi)的某些功能[8]。將hiPSCs與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人類間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)會(huì)形成一個(gè)微小的血管化3D結(jié)構(gòu)，即肝芽(Liver buds)[9]。然而該類器官缺乏膽管結(jié)構(gòu)，可能會(huì)阻礙這種模型的長期使用。目前開發(fā)了肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞或膽管細(xì)胞共培養(yǎng)的系統(tǒng)來提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

(三)生物打印肝臟 生物打印是使用計(jì)算機(jī)控制，以細(xì)胞或細(xì)胞聚集體為原料，逐層或逐點(diǎn)地構(gòu)建組織和器官的一種打印技術(shù)[10]。與2D培養(yǎng)系統(tǒng)相比，將hiPSC-HLCs在明膠中進(jìn)行生物打印，可提高白蛋白分泌、尿素產(chǎn)生能力以及多種CYP的表達(dá)水平[11]。

(四)微芯片 微芯片添加了一個(gè)相當(dāng)于血液流動(dòng)的裝置即微流控系統(tǒng)，提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)并排出廢物，從而可以更好地模擬體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境。有報(bào)道稱在芯片上創(chuàng)造從常氧到嚴(yán)重缺氧的氧濃度梯度，可以模擬肝臟中產(chǎn)生的生理氧梯度，從而用于研究體內(nèi)肝臟分區(qū)的形成。與靜態(tài)系統(tǒng)相比，hiPSC-HLCs的3D流體芯片模型具有顯著的肝臟特異性功能，包括白蛋白和尿素的產(chǎn)生能力以及代謝能力[12]。

然而，生物打印肝臟和微芯片都是由人為設(shè)計(jì)和制造而成，因此它們的使用只能限制在我們對(duì)器官的認(rèn)知范圍內(nèi)。

(五)封裝系統(tǒng) 封裝是指將細(xì)胞包裹在由水凝膠制成的半透球中，其中水凝膠可以根據(jù)需要進(jìn)行化學(xué)修飾以調(diào)整其孔隙大小。在該系統(tǒng)中，可以通過水凝珠進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、二氧化碳的交換和信號(hào)傳遞，并且允許生長因子、代謝物和廢物的擴(kuò)散以及防止抗體的入侵。將hPSCs球體或類器官封裝在海藻酸多聚-L-賴氨酸水凝珠中可以保持細(xì)胞活力，并允許其向肝細(xì)胞的分化。在小鼠中成功植入了被包裹的hiPSC-HLCs聚合體，其血液中人白蛋白的分泌水平與PHHs相似[13]。

四、hPSC向肝細(xì)胞分化的應(yīng)用研究進(jìn)展

(一)疾病建模 從患者活檢組織中獲得的hiPSCs分化為一種特定的細(xì)胞類型，可以進(jìn)行遺傳病的體外建模，例如hiPSC-HLCs可用于膽固醇代謝調(diào)節(jié)的研究。然而這些模型的生存能力在很大程度上依賴于分化細(xì)胞的特性和功能，就肝細(xì)胞而言，模型的建立可能會(huì)受到細(xì)胞成熟不完全的限制。

使用人體類器官模擬遺傳病包括α-1抗胰蛋白酶缺乏癥和囊性纖維化[14]，然而，在大多數(shù)情況下，人們只通過研究相關(guān)蛋白的表達(dá)來研究特定突變的影響，受突變影響的下游網(wǎng)絡(luò)往往缺乏文獻(xiàn)記載。除單基因疾病外，iPSC-HLCs類器官與游離脂肪酸聯(lián)合處理可模擬非酒精性脂肪性肝病的脂質(zhì)堆積和纖維化過程。

(二)毒理學(xué)研究 HLCs可以保留一些供體細(xì)胞的表型，對(duì)更罕見的表型進(jìn)行可重復(fù)建模，它還兼具PHH的代謝能力以及癌細(xì)胞系的增殖能力和重復(fù)性，使用HLCs作為肝臟模型進(jìn)行毒理學(xué)研究具有良好的前景。但在體內(nèi)觀察到的毒性反應(yīng)是由不同細(xì)胞類型之間復(fù)雜的相互作用介導(dǎo)的，使用單一肝細(xì)胞培養(yǎng)物模擬藥物誘導(dǎo)的肝毒性作用有限，將HLCs與支持細(xì)胞共培養(yǎng)可以在一定程度上延長其肝功能的維持。

(三)藥物篩選 藥物篩選是用來研發(fā)可以選擇性地與基因和基因產(chǎn)物相互作用的藥物，或者可以干擾特定分子機(jī)制的藥物，以便將這些藥物用于人類臨床試驗(yàn)。藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)知識(shí)的運(yùn)用在藥物篩選中至關(guān)重要。使用2D模型篩選的過程中，塑料吸附等現(xiàn)象可能會(huì)影響劑量和藥物效應(yīng)的關(guān)系。三維球體、類器官和器官芯片更適合用于研究藥物的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。

(四)生物人工肝 BALs的原理是將患者血漿通過體外循環(huán)與生物反應(yīng)器中的人肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，短時(shí)間替代肝臟工作，并促進(jìn)受損肝臟再生修復(fù)，可幫助部分肝衰竭患者恢復(fù)肝功能。BALs需要大量的肝細(xì)胞來維持患者的血液透析和肝臟功能，PSC-HLCs可以作為其中的生物成分，但它們的長期生存能力低，以及生產(chǎn)成本高阻礙了其快速應(yīng)用。

(五)組織工程的臨床應(yīng)用 由于健康供體組織的數(shù)量有限，以及組織排斥反應(yīng)存在風(fēng)險(xiǎn)，再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用受到了一定程度的限制，使用同基因或人類白細(xì)胞抗原(HLA)相容的hiPSC-HLCs可以克服這一障礙。一種方法是將hiPSCs接種到脫細(xì)胞的人肝細(xì)胞外基質(zhì)支架上進(jìn)行分化，與標(biāo)準(zhǔn)分化相比，使用肝臟脫細(xì)胞支架會(huì)導(dǎo)致肝功能標(biāo)志物上調(diào)，一些轉(zhuǎn)錄因子和核因子的表達(dá)水平與成人PHH相當(dāng)[15]。另一種方法是使用PSC衍生的類器官[16]。對(duì)于類器官移植而言，如何在冷凍保存后，仍然能制備可擴(kuò)增的、重復(fù)性高且穩(wěn)定的類器官模型是最后的挑戰(zhàn)。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道稱，hESC來源的類器官可以擴(kuò)增20代，并且能穩(wěn)定地保持雙潛能前體細(xì)胞的表型特征[17]。在小鼠體內(nèi)移植后，它們可以分化為有功能的肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞，并展現(xiàn)出顯著的再殖能力。

此外，研究者把hiPSCs來源的細(xì)胞組成的肝芽異位移植到免疫缺陷的小鼠身上，發(fā)現(xiàn)肝芽可以快速地與小鼠的血管連接并且在10 d之后開始正常運(yùn)作，移植到小鼠體內(nèi)的肝芽在代謝方面與成人肝臟具有相似性。將肝芽移植到ALF小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ALF小鼠存活率提高，表明移植到體內(nèi)的肝芽具有肝臟自我修復(fù)能力，可作為橋梁發(fā)揮治療作用[9]。

五、hPSC來源的類器官在臨床治療應(yīng)用中的限制

(一)實(shí)用操作問題 分化細(xì)胞的自體移植不僅需要將患者的細(xì)胞重編程為hiPSCs，還需要在患者患有單基因疾病的情況下，校正其基因以及促進(jìn)其向肝細(xì)胞分化。這些過程可能需要3～4個(gè)月的時(shí)間，因此這種方法只適用于中度或較輕的病例。此外，還應(yīng)該考慮到hiPSC-HLCs高昂的生產(chǎn)成本。隨著人類白細(xì)胞抗原(HLA)特征化凍存細(xì)胞庫以及即用型細(xì)胞治療產(chǎn)品的發(fā)展，同種異體移植的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)出來，因此，應(yīng)開發(fā)有效的低溫保存方法來維持冷凍前肝細(xì)胞功能。目前很難大規(guī)模生產(chǎn)類器官，因?yàn)樗枰狿SCs的大規(guī)模培養(yǎng)，將類器官生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化(至少部分自動(dòng)化)十分必要。

最后還需要確定肝細(xì)胞移植的途徑。門靜脈內(nèi)注射可以將大量細(xì)胞輸送到肝竇，在無肝纖維化的患者中耐受性良好，然而這一方法可能導(dǎo)致門靜脈壓力升高，增加門靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。還有一種方法是使用海藻酸鹽水凝珠包裹肝細(xì)胞來進(jìn)行移植，可以保護(hù)肝細(xì)胞不受患者免疫反應(yīng)的排斥，這種方法在臨床前研究中產(chǎn)生了很好的療效。

(二)PSC-HLCs的安全問題 已建立GMP級(jí)別PSC株，可分化為肝細(xì)胞，并且具有高度可復(fù)制的表型和功能。對(duì)于最終產(chǎn)品質(zhì)量的控制，不僅要考慮其功能，還要保證其安全性。hPSC-HLCs具有潛在的遺傳不穩(wěn)定性,雖然不是所有的突變均會(huì)產(chǎn)生不良影響或形成腫瘤，但使用hPSC-HLCs必須保證PSCs基因組完整性。目前，細(xì)胞在分化為hiPSC-HLCs過程中基因組完整性的保存缺乏文獻(xiàn)記載，而且尚未建立分化方案和其遺傳完整性之間的聯(lián)系，這方面還需要進(jìn)一步研究。此外還需考慮到最終治療產(chǎn)品中殘留的hPSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的可能性。

許多研究小組對(duì)hPSC-HLCs的免疫原性進(jìn)行了研究，一部分表明免疫系統(tǒng)對(duì)它們有很好的耐受性[18],另一部分根據(jù)所使用的細(xì)胞系不同而顯示出不同的免疫反應(yīng)[19]。

(三)hPSC-HLCs在臨床應(yīng)用中的倫理問題 由于hPSC-HLCs的來源和對(duì)hESCs的潛在應(yīng)用，該技術(shù)在細(xì)胞治療中的使用涉及到倫理問題。細(xì)胞治療、基因治療和組織工程都需要隨著生物醫(yī)學(xué)或再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)的進(jìn)步以及PSC研究等新領(lǐng)域的出現(xiàn)而迅速修訂相關(guān)法規(guī)。

綜上，由于PHHs來源有限以及在體外肝功能會(huì)迅速喪失，現(xiàn)已建立了一系列培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)hPSC向肝細(xì)胞分化，并且在體外長期維持肝細(xì)胞功能。該系統(tǒng)可以作為藥物篩選和毒性分析的一種理想模型。目前已將臨床級(jí)別的PSC-HLCs用于臨床治療研究，但該技術(shù)的發(fā)展還需細(xì)胞生物學(xué)、臨床護(hù)理、生物工程和生物相容性材料科學(xué)等多學(xué)科跨學(xué)科的合作，才能在未來實(shí)現(xiàn)更好的應(yīng)用前景。