楊瑞芳，蒙建州，李傳友

·綜述·

新型抗結(jié)核化合物體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)方法的研究進(jìn)展

楊瑞芳，蒙建州，李傳友

101149 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)菌免疫室（楊瑞芳、李傳友）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室（蒙建州）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性呼吸道傳染病，是全球十大死因之一，也是由單一傳染源導(dǎo)致死亡的主要原因，排名高于艾滋病。2019 年因 TB 死亡的人數(shù)是 120 萬(wàn)人[1]。MTB 具有特殊的生理特征，包括生長(zhǎng)緩慢、自然狀態(tài)下基因突變率較高以及用藥后易形成持留菌株等，導(dǎo)致 TB 治療用藥周期較長(zhǎng)、患者的依從性較差，因此耐藥 MTB 的檢出率不斷攀升。2020 年最新 WHO報(bào)告顯示，全球 2019 年估計(jì)有 1000 萬(wàn)TB 新發(fā)病例，有近 50 萬(wàn)人罹患利福平耐藥結(jié)核病（rifampicin resistant tuberculosis，RR-TB），其中 78% 患有耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）[1]。目前，由敏感菌引起 TB 的治療方案是異煙肼（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）共同給藥 2 個(gè)月，然后 INH 和 RIF 再給藥4 個(gè)月，而耐藥 TB 療程可達(dá) 24 個(gè)月。漫長(zhǎng)的治療周期也增加了耐藥菌的出現(xiàn)概率[2-3]。我國(guó)是 TB 高發(fā)國(guó)家，隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、人口流動(dòng)性增大，TB 嚴(yán)重威脅著公共健康?？蒲姓邆冎铝τ谛滦涂菇Y(jié)核藥物的篩選和研究，但進(jìn)展卻極為緩慢。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)只有貝達(dá)喹啉和德拉馬尼兩種對(duì)各類(lèi)耐藥 MTB 有效的新藥上市[4-5]，然而，這兩種藥物都具有較強(qiáng)的心臟毒性，而且臨床也很快發(fā)現(xiàn)了對(duì)這兩種藥物具有耐藥性的 MTB 突變菌株[6-7]。此外，普托馬尼（PA-824）是美國(guó) FDA 于 2019 年批準(zhǔn)的治療 TB 的藥物，并同貝達(dá)喹啉（B）和利奈唑胺（L）組成 BPaL 方案治療成人 XDR-TB 和 MDR-TB。但是，由于目前 PA-824 治療 TB 的臨床試驗(yàn)和安全性存在一定的局限性，仍需進(jìn)一步的研究提供更多的數(shù)據(jù)支持[8-9]。因此，開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物，有效控制 TB 已成為亟待研究的重要課題[10]。

目前獲得新型抗結(jié)核藥物研究策略主要采用高通量篩選模型獲得一些對(duì) MTB 具有抑制活性的化合物，但是在基于靶標(biāo)的分子水平篩選模型研究中，化合物通常缺乏針對(duì)整個(gè)細(xì)胞的活性，因此成功率較低[11-12]。而細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型通常是以菌株的存活或生長(zhǎng)為指標(biāo)，直接獲得具有抑菌活性的化合物樣品。幾乎全部的抗結(jié)核藥物都是通過(guò)這種篩選方式獲得[13-14]。這也表明全細(xì)胞表型高通量篩選技術(shù)主導(dǎo)了抗結(jié)核化合物的發(fā)現(xiàn)，采用這一研究策略更有可能獲得具有開(kāi)發(fā)前景的、具有全新作用機(jī)制的候選藥物[15]。對(duì)通過(guò)全細(xì)胞表型高通量篩選獲得苗頭化合物進(jìn)行體內(nèi)外抗結(jié)核活性評(píng)價(jià)是評(píng)估化合物開(kāi)發(fā)價(jià)值的重要環(huán)節(jié)。因此，本文就化合物體外和體內(nèi)抗結(jié)核活性評(píng)價(jià)兩方面進(jìn)行闡述。

1 抗結(jié)核體外活性評(píng)價(jià)

1.1 最小抑菌濃度

化合物通過(guò)抑制 MTB 的生長(zhǎng)或殺滅菌株而發(fā)揮抗結(jié)核作用。因此，化合物對(duì) MTB 菌株最小抑菌濃度（MIC）成為評(píng)價(jià)化合物體外活性的一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，可以快速評(píng)價(jià)樣品的活性。目前，測(cè)定化合物 MIC 的常用方法可以分為兩大類(lèi)，一是傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基表型檢測(cè)方法；二是液體培養(yǎng)基中 MTB 的生長(zhǎng)或能量代謝反應(yīng)檢測(cè)方法。

固體培養(yǎng)基檢測(cè)方法以瓊脂稀釋法為代表，基本原理是將不同劑量的化合物加入Middlebrook 7H10 固體培養(yǎng)基中，制成含不同遞減濃度梯度的平板，采用比例法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以不含有化合物處理組為陰性對(duì)照，培養(yǎng)三周后計(jì)算兩組菌落生長(zhǎng)數(shù)比值，能夠抑制 99% 或更高 MTB 生長(zhǎng)的藥物濃度被認(rèn)為是其最低抑菌濃度。但是，該方法培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，化合物容易降解，使結(jié)果偏高[16]。液體培養(yǎng)基常見(jiàn)檢測(cè)方法是運(yùn)用液體培養(yǎng)基對(duì)抗結(jié)核化合物進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛鹊幕衔铮臃N新鮮 MTB（濃度約 106CFU/ml），培養(yǎng) 2 ～ 3 周后，肉眼觀(guān)察菌的生長(zhǎng)情況，以恰好無(wú)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度為 MIC。96 孔板法的使用，可控性好，結(jié)果準(zhǔn)確[17]。但是，這種方法也存在一定的缺點(diǎn)，包括肉眼觀(guān)察可能產(chǎn)生的誤差，以及不能準(zhǔn)確判斷實(shí)驗(yàn)中的污染情況[18]。

近年來(lái)，在 96 孔板法的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基中加入氧化或還原試劑后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，在MTB 的代謝作用下發(fā)生還原反應(yīng)，使顏色發(fā)生變化。其顯色程度與培養(yǎng)基中的活菌數(shù)成正比，可以間接測(cè)定 MIC[18]。最初用的顯色劑是噻唑藍(lán)（MTT），在活細(xì)胞的代謝作用下還原為難溶性的紫色結(jié)晶物沉積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng) DMSO 溶解后通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定（波長(zhǎng)為590 nm）。近年來(lái)，Alarm Blue 顯色劑的發(fā)現(xiàn)，使越來(lái)越多的研究者們趨向于應(yīng)用這種方法來(lái)檢測(cè) MTB 的MIC，文獻(xiàn)報(bào)道均顯示具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，因此被廣泛使用[19-20]。

此外，耐藥菌的出現(xiàn)日漸成為未來(lái)抗結(jié)核研究中，特別是抗結(jié)核藥物的研發(fā)重點(diǎn)。因此，在抗結(jié)核化合物前期藥效學(xué)評(píng)價(jià)中，有必要測(cè)定化合物對(duì)臨床耐藥菌株以及 MTB 對(duì)其產(chǎn)生耐藥性頻率。

1.2 最小殺菌濃度

目前，臨床上抗結(jié)核菌的藥物分為抑菌和殺菌兩類(lèi)，抑菌劑通過(guò)抑制細(xì)菌繁殖發(fā)揮作用，而殺菌劑則是破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)菌死亡。通過(guò)體外試驗(yàn)確定藥物致殺率在 99.9% 左右，可以將藥物歸類(lèi)為殺菌藥物[21-23]。最小殺菌濃度（MBC）的檢測(cè)方法通常是在 MIC 的檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。因此，在測(cè)定 MIC 后，再配置 7H10 培養(yǎng)基平板，在 MIC 實(shí)驗(yàn)中無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)取部分菌涂 7H10 平板，在 37 ℃溫箱里再培養(yǎng) 3 ～ 4 周，進(jìn)行 CFU 計(jì)數(shù)，CFU 減少 99.9% 孔內(nèi)對(duì)應(yīng)的化合物濃度即為 MBC。國(guó)外一項(xiàng)研究將 MTB 有氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)相，接種于含 4 種不同濃度化合物的含有 20% 吐溫 80 和 OADC的 7H9 培養(yǎng)基中，化合物在固定濃度下進(jìn)行測(cè)試，在沒(méi)有可用的 MIC 數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)物暴露于化合物中 21 d，并在第0、7、14 和 21 天通過(guò)計(jì)數(shù)瓊脂平板上的菌落形成單位來(lái)測(cè)定細(xì)胞活力。MBC 被定義為 21 天內(nèi)達(dá)到 2log 致死所需的最低濃度[24-25]。

1.3 對(duì) MTB 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

通過(guò)對(duì) MTB 標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv MIC 和 MBC 的測(cè)定，可以明確化合物對(duì) MTB 的抑菌和殺菌活性。在 MIC 結(jié)果的基礎(chǔ)上，滕麗艷[26]通過(guò)用 1/4 MIC 化合物 E 處理 H37Ra 菌株并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，同時(shí)以正常培養(yǎng)的 H37Ra 菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)做對(duì)照，發(fā)現(xiàn)化合物 E 在亞抑制濃度下，H37Ra 菌株仍在繼續(xù)生長(zhǎng)，只是速度減慢，進(jìn)一步表明化合物 E 對(duì) MTB 的生長(zhǎng)有抑制作用。因此，化合物對(duì) MTB 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響也可以作為新型抗結(jié)核化合物體外抗結(jié)核活性的一項(xiàng)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4 對(duì)持留態(tài) MTB 活性的抑制

人們常將 MTB 在宿主體內(nèi)以非增殖方式存在而造成延緩性病程或?qū)е聫?fù)發(fā)的潛伏菌群稱(chēng)為持留菌。而持留菌的存在使感染患者體內(nèi)細(xì)菌潛伏造成 TB 病程遷延和復(fù)發(fā)，使 TB 的治療面臨挑戰(zhàn)。目前所使用的抗生素中，除了吡嗪酰胺對(duì)持留菌有抑制活性外，其他大部分的藥物只對(duì)復(fù)制期的 MTB 起作用[23]。因此，尋找對(duì)持留菌有效的藥物是對(duì)抗結(jié)核病耐藥問(wèn)題、縮短用藥周期的有效手段。Loebel等[27]早在 1933 年就發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)，或是在培養(yǎng)基和鹽水中暴露于厭氧條件下一段時(shí)間后，MTB 生長(zhǎng)會(huì)受到抑制而處于休眠期。此外，研究者們也發(fā)現(xiàn)其他許多因素，包括 pH 值的變化，NO、CO、金屬離子的過(guò)量和不足以及磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏等也可能導(dǎo)致 MTB 在宿主中的休眠狀態(tài)。但是，目前為止，缺氧誘導(dǎo)和營(yíng)養(yǎng)缺乏模型因較為簡(jiǎn)單，且容易操作而更為常用[28-29]。

在缺氧或不含甘油和 OADC 的 7H9 培養(yǎng)基中培養(yǎng) MTB 模擬持留狀態(tài)，分別取培養(yǎng) 3 周和 2 個(gè)月的H37Rv菌 5 ml 左右，振蕩 2 ～ 3 min 打散后靜止 30 min 使菌沉淀，加入不同的 EP 管并調(diào)節(jié)菌的濃度至600= 0.1，取適量菌液加入兩個(gè)含培養(yǎng)基的瓶中，至菌濃度為 l ×106CFU/ml，各自加入濃度為 2.5 mg/ml 的化合物和 INH（陽(yáng)性對(duì)照），不加化合物為陰性對(duì)照。37 ℃恒溫溫箱內(nèi)孵育 3 d 后洗滌菌液并稀釋成不同濃度涂 7H10 平板，37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3 ～ 4 周后 CFU 計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)化合物對(duì)處于持留狀態(tài)的結(jié)核桿菌是否具有殺菌作用[23]。

2 體內(nèi)抗結(jié)核活性

2.1 傳統(tǒng)動(dòng)物模型對(duì)新型抗結(jié)核化合物的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)

藥物進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮抗菌作用涉及藥物對(duì)機(jī)體的作用以及機(jī)體對(duì)藥物的代謝，評(píng)價(jià)化合物具有體內(nèi)抑菌活性是新藥研發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵步驟，動(dòng)物模型被證實(shí)對(duì)篩選新藥以及更好地理解宿主-病原體關(guān)系是非常重要的，不同的動(dòng)物模型在 TB 研究中具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。

小鼠由于價(jià)格低廉、遺傳及免疫背景清楚、操作簡(jiǎn)單、T 細(xì)胞在 MTB 感染免疫應(yīng)答中的作用和人類(lèi)一致等優(yōu)點(diǎn)，成為制備 TB 模型最常用的動(dòng)物。但是，小鼠在初次感染后盡管疾病被控制，但 MTB 量仍保持較高水平，導(dǎo)致疾病呈慢性進(jìn)行性。此外，MTB 感染后缺乏人類(lèi)的病理特征，如干酪樣肉芽腫很少發(fā)展為壞死、液化及空洞，而且肺組織出現(xiàn)壞死性改變的時(shí)間較長(zhǎng)、肺部荷菌量改變幅度較小，不利于對(duì)治療和保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，限制了小鼠在 TB 研究中的應(yīng)用[30-31]。而豚鼠感染 MTB 后，可以形成壞死的原發(fā)性肉芽腫，因此，常用于 TB 發(fā)病機(jī)制、病理和免疫的研究中[31]。鄭梅琴等[32]通過(guò)構(gòu)建豚鼠 TB 模型，探討異煙肼、莫西沙星、氯法齊明、JYS-1 和 JYS-2 的抗結(jié)核活性。國(guó)外一項(xiàng)研究應(yīng)用 SPF 雌性 SD 大鼠 MTB 感染模型，通過(guò)檢測(cè)血清中的菌濃度評(píng)價(jià)苯并噻嗪酮的體內(nèi)抗結(jié)核活性，發(fā)現(xiàn)苯并噻嗪酮是一種有效的臨床耐藥 TB 的治療前候選藥物[33]。Horváti 等[34]通過(guò)建立豚鼠結(jié)核感染模型，對(duì)抗結(jié)核新藥乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA-pT8 進(jìn)行了體內(nèi)藥物毒性和抗結(jié)核活性的檢測(cè)。但是，豚鼠因感染 MTB 后缺乏潛伏期，且價(jià)格較昂貴而存在一定局限性。

兔子感染 MTB 后可形成干酪樣肉芽腫，而且具有潛伏期，因此，也常用于 TB 的研究。缺點(diǎn)是需要高劑量 MTB 才能建立感染模型[35]。Rifat 等[36]利用兔結(jié)核感染模型，評(píng)估利福噴丁對(duì)不同類(lèi)型 TB 病灶的滲透性，發(fā)現(xiàn)它對(duì)肺空洞病變的滲透性差，且部分解釋了在II 期臨床試驗(yàn)中，改善治療效果所需的劑量在肺結(jié)核大空洞患者中是無(wú)空洞肺結(jié)核患者的4 倍。

斑馬魚(yú)發(fā)育周期短、繁殖產(chǎn)量高，與人類(lèi)基因組具有相似性、具有良好的先天免疫系統(tǒng)以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的特點(diǎn)[37]，常被用作 TB 模型和藥物篩選工具。劉紅旭等[38]通過(guò)建立斑馬魚(yú)-海分枝桿菌感染模型科學(xué)、有效地研究TB 的免疫病理機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)新型抗結(jié)核藥物。國(guó)外多項(xiàng)研究也證實(shí)了斑馬魚(yú)在抗結(jié)核機(jī)制研究具有重要的意義[39-41]。但是，斑馬魚(yú)缺乏 TB 的主要感染器官，且自身并不能很好地清除感染菌，因此在實(shí)驗(yàn)研究中存在局限[37-38]。

果蠅繁殖快、成本低、操作簡(jiǎn)單，且有類(lèi)似脊椎動(dòng)物的吞噬細(xì)胞和固有免疫信號(hào)途徑[42]，但缺乏 T、B 細(xì)胞，因此，可以作為研究人對(duì) TB 的固有免疫反應(yīng)的模型，且需要在哺乳動(dòng)物中進(jìn)一步驗(yàn)證[43]。Pushkaran 等[44]通過(guò)建立 MTB 感染果蠅模型顯示了阿莫西林-克拉維酸和地奧司明作為一種協(xié)同的聯(lián)合治療 TB 的潛力。

2.2 小動(dòng)物活體成像技術(shù)在新型抗結(jié)核化合物體內(nèi)活性評(píng)價(jià)的應(yīng)用

小動(dòng)物活體成像技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)，可應(yīng)用于 MTB 在活體內(nèi)對(duì)新型抗結(jié)核化合物的反應(yīng)進(jìn)行觀(guān)察。與傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，該技術(shù)可以對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象持續(xù)觀(guān)察，避免因多個(gè)時(shí)間點(diǎn)造成的個(gè)體差異，減少動(dòng)物的使用量，而且具有更高的靈敏性，可以在感染早期便進(jìn)行活體觀(guān)察，從而篩選出藥物的最佳劑量以及給藥濃度和時(shí)間，還可觀(guān)察記錄不同劑量藥物對(duì)活體的毒副作用，更便捷地評(píng)估藥物效力[45]。目前，生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)因其特異性強(qiáng)而用于小動(dòng)物活體成像技術(shù)，它是在 ATP、鎂離子和氧氣的參與下，通過(guò)底物熒光素與表達(dá)的熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的光子而發(fā)揮作用[35]，Arranz 和Ripoll[46]描述了生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)可用于藥物靶向分布的觀(guān)察，從而進(jìn)行藥效學(xué)的評(píng)估。

3 小結(jié)

近幾年來(lái)，MDR 和 XDR 的不斷出現(xiàn)和增加，全球范圍內(nèi) TB 形勢(shì)愈加嚴(yán)峻。因此，開(kāi)發(fā)新型高效的抗結(jié)核藥物是有效控制 TB 的主要策略，特別是篩選出具有抗耐藥 MTB 及持留狀態(tài) MTB 的藥物研究已經(jīng)越來(lái)越引起人們的重視。然而，新型抗結(jié)核藥物的研究是一個(gè)極其復(fù)雜且重要的過(guò)程，而體內(nèi)外抗結(jié)核活性的評(píng)價(jià)是研究抗菌藥物的第一步，也是必要的一步。本文綜述了體外檢測(cè)化合物對(duì) MTB 標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv 和臨床耐藥菌株的 MIC、MBC 和體外制備持留菌檢測(cè)化合物對(duì)潛伏狀態(tài) MTB 的抗結(jié)核活性，以及多種臨床前動(dòng)物模型的建立來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)抗菌活性等方法。然而，很多研究如化合物與 INH、RIF 等一線(xiàn)抗菌藥物的聯(lián)合和交叉抗結(jié)核活性，以及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法等需要進(jìn)一步的探究，從而減少耐藥菌以及毒副作用的出現(xiàn)。此外，目前新型抗結(jié)核化合物多采用胞外檢測(cè)抗菌活性，而 MTB 侵入機(jī)體后，巨噬細(xì)胞的吞噬作用是極為重要的抗菌免疫應(yīng)答機(jī)制，因此，檢測(cè)化合物對(duì)胞內(nèi) MTB 的影響也是非常必要的。綜上所述，盡管新型抗結(jié)核化合物的體外活性體系仍需要完善，但是通過(guò)經(jīng)典的 MIC、MBC 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)新型抗結(jié)核化合物的體外抗菌活性及處于休眠期 MTB 的抑制活性，使其可作為未來(lái)抗結(jié)核藥物候選物的先導(dǎo)化合物，從而保證后續(xù)新型抗結(jié)核藥物的順利研發(fā)，仍然具有十分重要的意義。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（81803412）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-1-013）；北京市臨床重點(diǎn)專(zhuān)科項(xiàng)目

李傳友，Email：lichuanyou6688@hotmail.com

2020-11-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.010