余建華 張艷洪 鄒小鳳 朱文婷 李 鑫 陳美琪

1.廣東省東莞康華醫(yī)院血液病中心實驗室，廣東東莞 532080；2.廣東省東莞康華醫(yī)院腫瘤科，廣東東莞 532080；3.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州 510515

感染性疾病是臨床常見疾病之一，該病起病急、進展快，且臨床上不同病原體所致的感染其臨床表現(xiàn)常不易甄別，常導致診治困難。病原菌未及時清除，感染進展常導致患者多器官功能衰竭而死亡。因此，早診、早治，對感染治療尤為重要，有助于改善預后。研究顯示，中性粒細胞CD64 指數(shù)（nCD64 index）可用于診斷細菌感染，且不受激素、抗生素和感染部位的影響[1-4]；單核細胞HLA-DR（mHLA-DR）在細菌感染時降低，而在病毒感染時明顯升高[5-6]。聯(lián)合檢測nCD64 index 和mHLA-DR 在感染性疾病中的研究報道較少[7]。本研究旨在探討利用流式術(shù)檢測外周血nCD64 index和mHLA-DR 表達水平在感染性疾病診斷中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月—11 月在東莞康華醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治的74 例發(fā)熱患者的臨床資料，根據(jù)病因分為兩組，其中40 例膿毒癥患者作為細菌感染組，男24 例，女16 例，年齡21～93 歲，平均（51.55±17.19）歲；其他登革熱患者34 例作為病毒感染組，男16 例，女18 例，年齡21～80 歲，平均（49.12±18.01）歲。選取我院同期健康體檢者40 名作為健康對照組，男19 名，女21 名，年齡17～85 歲，平均（47.00±18.97）歲。三組性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①細菌感染組臨床診斷為膿毒癥，且血培養(yǎng)和/或無菌體液培養(yǎng)陽性；②病毒感染組臨床診斷為登革熱，登革病毒IgM 抗體和/或登革病毒NS1 抗原檢測陽性[8]。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑

采用貝克曼庫爾特Navios 型流式細胞儀，使用抗體試劑名稱：CD45-FITC、CD14-PE、CD64-PE-cy5、CD19-PE-cy7、HLA-DR-Pacific Blue。開機時用Flow-Check 微球進行光路和液流的校準，保證儀器在檢測期間具有良好的運行狀態(tài)。

1.3 檢測方法

CD64 和HLA-DR 采用EDTA 抗凝靜脈血上流式細胞儀檢測，依次取50 μL 全血，加上述抗體各2 μL，混勻、室溫避光孵育抗體15 min，加1.5 mL NH4Cl 紅細胞裂解液作用10 min，再300g離心5 min棄上清，加100 μL PBS 重懸上機檢測。檢測方案及數(shù)據(jù)分析見圖1。nCD64 index=[中性粒細胞CD64 的平均熒光強度（nCD64）/淋巴細胞CD64 的平均熒光強度（Ly-CD64）]/[單核細胞CD64 的平均熒光強度（mCD64）/nCD64][1]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（）表示，三組比較用單因素方差檢驗。計量資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗。偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，三組比較用Kruskal-WallisH檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用受試者工作曲線（ROC）分析各指標鑒別感染的診斷價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群CD64 和HLA-DR 指標表達水平比較

圖1 檢測方案及數(shù)據(jù)分析流程

三組人群nCD64、mCD64、nCD64 index、nHLADR、mHLA-DR、bHLA-DR、mHLA-DR+（%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細菌感染組nCD64 和nCD64 index 水平高于健康對照組和病毒感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病毒感染組nHLA-DR、mHLADR 和mHLA-DR+（%）顯著高于健康對照組和細菌感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 nCD64、nCD64 index、mHLA-DR 和mHLA-DR+（%）單獨檢測對細菌與病毒性感染診斷的效能評價

nCD64 index 的曲線下面積顯著高于nCD64、mHLADR+（%）、mHLA-DR，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各指標的截斷值分別是0.53、30.8、325 和93.9%。各指標ROC 曲線和曲線下面積見表2、圖2。

2.3 CD64 和HLA-DR 聯(lián)合檢測對細菌與病毒性感染診斷的效能評價

nCD64 index 與mHLA-DR 聯(lián)合檢測ROC 曲線下面積最大為0.791，靈敏度（95.00%）和特異度（94.12%）。各聯(lián)合檢測比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

表1 三組人群CD64 和HLA-DR 表達水平比較[M（P25，P75）]

表2 CD64 和HLA-DR 各檢測指標ROC 曲線下面積及診斷效能評價

圖2 CD64 和HLA-DR 各檢測指標對感染的ROC 分析曲線

3 討論

早期識別感染性疾病的發(fā)生，針對致病微生物實施合理治療，對于改善患者預后具有重要意義[9]。而細菌學培養(yǎng)陽性率低，病毒分離耗時長，無法指導早期治療決策的制訂[10]。臨床常用的感染輔助診斷指標：白細胞分類計數(shù)、C 反應蛋白、降鈣素原等，存在特異性低、易受治療用藥影響等局限性[11-12]。

CD64 是免疫球蛋白IgG 的Fc 段Ⅰ型受體，主要分布于單核、巨噬和樹突細胞表面，其表達受細胞因子的調(diào)控[13]。生理狀態(tài)下中性粒細胞表面CD64（nCD64）低表達，當受到細胞因子刺激，nCD64 表達4～6 h 迅速上調(diào)10 倍，22 h 達到高峰[14]。nCD64 表達穩(wěn)定，4℃可保存72 h，且不易受糖皮質(zhì)激素[15]和抗生素的干擾[1]。當除去刺激因素時，nCD64 表達逐步降低，并在7 d 內(nèi)恢復正常[16]。本研究結(jié)果顯示在病毒感染時mCD64 明顯升高，nCD64 輕度升高；在細菌感染時mCD64 和nCD64 同時顯著增高[17-18]，nCD64 index綜合了mCD64 和nCD64 的變化，優(yōu)于nCD64 單獨報告。nCD64 index 的截斷值與既往研究不同[2,19-21]，是由于在各實驗室設置檢測方案時檢測熒光通道不同、儀器的電壓不同，導致本底陰性值（LyCD64）和陽性值（mCD64）不同，進而nCD64 index 計算值不同。nCD64 index 與mHLA-DR 聯(lián)合檢測時，結(jié)合兩者的優(yōu)勢，獲得最大曲線下面積及較高靈敏度和特異度（95.00%、94.12%）。因此，建議nCD64 index 與mHLADR 聯(lián)合檢測，并建立自己實驗室的參考區(qū)間。

圖3 nCD64 index 和mHLA-DR 聯(lián)合檢測對感染ROC 分析曲線

HLA-DR 是外源性抗原肽遞呈和誘導適應性免疫應答過程中的重要蛋白分子，主要表達于單核細胞、DC 細胞。mHLA-DR 表達持續(xù)降低是機體“免疫麻痹”的良好指標[22]，可以預測感染預后及發(fā)生二次感染的風險[23-24]。因此，mHLA-DR 更適合用于疾病中后期監(jiān)測病情用[25-26]。

綜上所述，nCD64 index 和mHLA-DR 聯(lián)合檢測，有助于鑒別診斷細菌與病毒性感染，為臨床診治提供切實可靠的數(shù)據(jù)支持。