劉青川 曹文斌 楊新波 王仁杰 王蒙蒙 黃正明

北京衛(wèi)健基業(yè)生物技術(shù)研究所藥理室，北京 100039

新型冠狀病毒肺炎疫情的暴發(fā)導(dǎo)致世界經(jīng)濟(jì)遭受巨大損失，人民健康受到嚴(yán)重威脅。2020 年2 月11 日，新型冠狀病毒所致的疾病被WHO 正式命名為“2019 冠狀病毒疾病”（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]；新型冠狀病毒被正式命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。截至2020 年9 月11 日，我國(guó)已累計(jì)報(bào)告確診病例85 174 例，累計(jì)死亡病例4634 例[2]。海外疫情則更為嚴(yán)重，感染和死亡人數(shù)仍處于快速增長(zhǎng)之勢(shì)，疫情形勢(shì)不容樂(lè)觀。此次疫情中，中醫(yī)藥學(xué)結(jié)合了對(duì)“疫”病的治療手段，在COVID-19 的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要作用。中藥水芹自《本草求真》《神農(nóng)本草》《本草綱目》等古籍就有記載，具有清熱解毒功能，主治黃病、小兒暴熱等證。近代研究發(fā)現(xiàn)，水芹中含有豐富的黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)物質(zhì)，這些活性成分對(duì)乙型肝炎和艾滋病等病毒感染性疾病具有良好的治療作用，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明其可顯著抑制病毒復(fù)制[3-4]；其作用機(jī)制與影響病毒DNA 聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的活性密切相關(guān)[5-6]。基于水芹抗病毒作用的研究，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，研究水芹的作用靶標(biāo)和信號(hào)通路，預(yù)測(cè)和分析其防治COVID-19 的可能性和潛在分子機(jī)制，為水芹治療COVID-19 的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Pre diction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；UniProt（http://www.uniprot.org/）；疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)：TTD（http://db.idrblab.net/ttd），OMIM（https://www.omim.org/），Drugbank（https://www.drugbank.ca/），GeneCards（http://www.genecards.org）；STRING（https://string-db.org）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 獲取水芹活性成分靶點(diǎn)

通過(guò)北京衛(wèi)健基業(yè)生物技術(shù)研究所研究和文獻(xiàn)查詢[7-9]，選取水芹的7 種活性成分：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、山奈酚、槲皮素、異鼠李素、金絲桃苷。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取各活性成分的靶點(diǎn)。用PubChem獲取各成分化學(xué)結(jié)構(gòu)并導(dǎo)入Swiss Target Prediction中，預(yù)測(cè)各成分相關(guān)靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果篩選合并，得到活性成分潛在靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)獲取

4 個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)以“COVID-19”“novel coronavirus pneumonia”“SARS-COV-2”進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)，得到COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.4 獲取活性成分-疾病共有靶點(diǎn)

將活性成分靶點(diǎn)和COVID-19 的疾病靶點(diǎn)取交集，獲得活性成分-疾病共有靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建水芹活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將共有靶點(diǎn)輸入STRING，限定種屬“Homo sapiens”，設(shè)置最低置信度0.4，得到活性成分-靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將得到的STRING 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，制作PPI 可視化圖，分析水芹對(duì)COVID-19 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將水芹活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 GO 和KEGG 富集分析

將活性成分-疾病共有靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析數(shù)據(jù)。GO 分析包含分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞學(xué)組分（cellular components，CC）三部分。分別選取GO、KEGG 前10 條主要信息，用R Studio 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和計(jì)算，繪制氣泡圖。

1.8 構(gòu)建“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將KEGG 富集分析結(jié)果和相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，制作“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 水芹活性成分和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

水芹的7 種活性成分中有部分成分已報(bào)道與COVID-19 治療密切相關(guān)[10]，故部分成分沒(méi)有按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18 進(jìn)行篩選。分析得到水芹各成分靶點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表1，所有靶點(diǎn)經(jīng)合并篩選后共有306 個(gè)。

表1 水芹中活性成分信息和潛在靶點(diǎn)

2.2 水芹防治COVID-19 疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)檢索4 個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選去重，獲得COVID-19 相關(guān)靶點(diǎn)355 個(gè)，用UniProt 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將水芹活性成分靶點(diǎn)與COVID-19 靶點(diǎn)相互交集，得到活性成分-疾病靶點(diǎn)共60 個(gè)。見(jiàn)表2。

2.3 活性成分-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 制作PPI 可視化網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有60 個(gè)節(jié)點(diǎn)，778 條連接邊，節(jié)點(diǎn)的顏色深淺和形狀大小與度值呈正比，分析得到20 個(gè)核心基因，其中TNF、IL-6、MAPK1、CASP3等為水芹活性成分與COVID-19 相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

表2 活性成分-疾病共有靶點(diǎn)信息

2.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

采用Cytoscape 進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)中共67 個(gè)節(jié)點(diǎn)（含活性成分和靶點(diǎn)），共110 條邊，其中重要靶點(diǎn)為T(mén)NF、IL-6、MAPK1、CASP3 等。見(jiàn)圖2。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用可視化網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 分析，得到497 個(gè)條目，分別選取排名前10 條目，繪制氣泡圖，見(jiàn)圖3。BP 涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等；MF 涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性等；CC 涉及細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞核、線粒體等。提示水芹活性成分可以通過(guò)調(diào)控多種生物學(xué)途徑防治COVID-19。

圖3 GO 富集分析氣泡圖

KEGG 通路富集分析獲得116 條信號(hào)通路。選取排名前10 條目，繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4，其中密切相關(guān)的通路主要有TNF、Toll 樣受體信號(hào)通路等。提示水芹防治COVID-19 的作用多樣性。

圖4 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.6 “靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)

選取前10 條KEGG 通路，將每個(gè)通路的靶點(diǎn)合并去重，得到43 個(gè)靶點(diǎn)。用Cytoscape 建立“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，圖中共53 個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)43 個(gè)、通路10 個(gè)）、192 條連接線，網(wǎng)絡(luò)密度為0.139，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.889，其中最為密切的是TNF 及其信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路，在COVID-19 中發(fā)揮著重要作用。見(jiàn)圖5。

3 討論

圖5 “靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是Hopkins[11]于2007 年提出的概念，依靠數(shù)據(jù)庫(kù)信息和計(jì)算機(jī)的輔助，對(duì)藥物治療疾病的作用靶點(diǎn)和通路進(jìn)行初步預(yù)測(cè)[12]。SARS-CoV-2 具有傳染性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng)、偽裝性強(qiáng)、攻擊免疫系統(tǒng)、感染者無(wú)癥狀等特點(diǎn)[13]，加大了COVID-19 科研工作的風(fēng)險(xiǎn)和難度。自疫情暴發(fā)以來(lái)，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為手段對(duì)中藥防治COVID-19 的研究大量涌出，該方法為中藥治療COVID-19 提供了理論基礎(chǔ)，拓展中藥研究新的研究思路，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化的進(jìn)展[14]。

SARS-CoV-2 感染過(guò)程中會(huì)過(guò)度激活宿主免疫應(yīng)答，釋放細(xì)胞因子和趨化因子，引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，造成肺部器官病變[15-16]。中藥對(duì)COVID-19 的治療主要通過(guò)解熱、抗感染、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多途徑，緩解細(xì)胞因子風(fēng)暴，達(dá)到治療作用[17-19]。細(xì)胞因子風(fēng)暴中，TNF 可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、分化和凋亡[20]。TNF 信號(hào)通路里MAPK、NF-κB 信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致促炎基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和造成組織損傷[21]。水芹中蘆丁、槲皮素、山奈酚、金絲桃苷均參與TNF 信號(hào)通路的調(diào)控，可能通過(guò)下調(diào)NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或MAPK 信號(hào)通路的活化，降低TNF-α、IL-6、CAPS3 等因子的釋放，緩解免疫反應(yīng)，降低肺炎癥程度[22-23]。Toll 樣受體是固有免疫病原模式識(shí)別受體，可識(shí)別激活天然免疫系統(tǒng)來(lái)抵抗病原微生物的入侵。Toll 樣受體通路中也有NF-κB、MAPK信號(hào)通路的參與，且NF-κB 是其下游樞紐，參與炎癥調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等[24]。水芹上述成分也可通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體通路、阻止NF-κB 磷酸化釋放進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥癥狀。有報(bào)道顯示，綠原酸也可以通過(guò)抑制機(jī)體的NF-κB 活化，促進(jìn)病原體侵染細(xì)胞的凋亡[25]。此外，蘆丁、金絲桃苷與新冠病毒的主要蛋白酶可通過(guò)非極性相互作用結(jié)合，抑制蛋白酶的活性，達(dá)到抗病毒效果[10]。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)水芹治療COVID-19的可能機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)水芹可參與TNF和Toll 樣受體通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生。水芹中活性物質(zhì)不僅限于本研究中的成分，其有效部位水芹總酚酸含量達(dá)到50%以上，除含上述成分外，尚有未明確的成分有待研究。如將水芹系統(tǒng)全面地論證，僅用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法是有缺陷和不足的，本研究結(jié)果可為水芹后期的實(shí)驗(yàn)研究指引方向和提供理論基礎(chǔ)。