張秀娟，張瑞紅，郝 晶，呂夢瀟，蘇 嬋，穆玉蘭**

(1.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦產科，濟南 250021；2.山東大學基礎醫(yī)學院，濟南 250012))

據統(tǒng)計，全世界每8對育齡夫婦中就有1對患不孕不育癥[1]，不孕不育已成為繼心腦血管和腫瘤之后威脅人類健康的第三大疾病，而腫瘤生育作為不孕不育治療領域的新型分支，其重要性逐漸受到重視。流行病學文獻報道，世界范圍內50歲以下婦女5%罹患腫瘤。由于腫瘤的早診斷和早治療措施的推廣，腫瘤患者5年生存率顯著提高，且年輕患者生存率顯著高于高齡患者。據報道，35歲以下乳腺癌患者的生存率為90.91%，35～45歲患者的生存率為57.84%[2]。化療作為腫瘤治療的重要方案，可導致卵巢不可逆轉損傷，因此育齡期婦女和青少年女性抗癌期間的生育力保存受到更多的關注[3]。美國生殖醫(yī)學協會(ASRM)推薦的生育力保存方式，僅有胚胎和成熟卵的凍存[4]。此外，若抗苗勒管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)基礎水平持續(xù)低于3.32ng/mL，放療后即使沒有閉經，也可能導致生育問題[5]。雖可長期使用激素補充治療(hormone replacement therapy，HRT)緩解圍絕經期癥狀，但不能防止其發(fā)生和進展，因此迫切需為早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者找到一種新的臨床治療策略。近年研究發(fā)現，卵巢組織、干細胞及其外泌體移植可部分或完全恢復化療性POI，其中外泌體以及其轉運的miRNA為POI的診治提供了新思路。

1 化療所致POI的病因及機制

POI是指卵巢功能衰竭所導致的女性在40歲之前出現閉經的現象，特點是原發(fā)或繼發(fā)性閉經，血促性腺激素水平升高、雌激素水平降低、卵泡數量減少等[6]。POI分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。原發(fā)性POI一般由遺傳、免疫、炎癥、酶代謝紊亂等引起，但大多原因未明；繼發(fā)性POI一般由手術、放療、化療和其他接觸毒性物質引起[7]。大劑量放療、化療或骨髓移植可使超過90%的年輕女性惡性腫瘤患者的病情得到緩解，但對卵巢功能和生育力造成不良影響?；熢斐陕殉补δ芩ネ说闹饕獧C制可分為兩類：(1)對卵母細胞和卵巢顆粒細胞(ovarian granulosa cells，OGCs)的直接毒性作用；(2)通過損傷生長卵母細胞間接造成原始卵母細胞過度活化從而耗竭[8]。其中化療藥物順鉑在化療過程中使原始卵母細胞庫持續(xù)激活、卵泡過度凋亡導致卵巢衰竭；而化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導卵巢間質細胞和顆粒細胞水腫和凋亡，通過線粒體釋放細胞色素c激活凋亡通路，誘導DNA損傷，從而消除高度分裂的細胞，如卵母細胞[9]。造成原始卵母細胞凋亡或激活的細胞信號傳導途徑之一為磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tension homolog,PTEN)依賴性信號途徑。研究表明，PTEN/AKT/FOXO3信號途徑參與了小鼠原始卵母細胞和體外培養(yǎng)的人卵母細胞的激活，而PTEN抑制劑則可解除其抑制功能[10]。Huang等[6]研究表明，化療后患者卵巢功能可出現一定程度的恢復,性激素改變及化療引起的閉經在一定程度上可以逆轉,恢復情況與化療藥物的累計劑量和卵巢損傷程度有關。但目前關于化療所致POI尚無明確的治療方法，只能根據相關臨床癥狀采取相應措施。

2 干細胞用于POI治療

POI患者使用HRT后，癌癥風險及副作用增加，因此科學家提出運用干細胞治療POI。干細胞是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞，并且已有研究表明人羊膜、臍帶、骨髓、脂肪等來源的間充質干細胞以及人羊膜上皮細胞、羊水干細胞卵巢注射可部分或完全恢復卵巢功能。但以干細胞為基礎的治療仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括移植排斥、腫瘤轉化、來源有限、倫理問題等，導致其在臨床應用中受到限制[11]?；诖?，研究者著眼于干細胞內的有效物質，發(fā)現外泌體不僅可治療某些疾病，還可在胚胎發(fā)育、配子發(fā)生和受精的生物學功能中發(fā)揮重要作用。相較于干細胞，外泌體具有低免疫原性、不致瘤性、高臨床安全性和低倫理風險等優(yōu)點[12]。國內外研究已證實，外泌體在改善POI方面具有重要作用。

3 外泌體用于POI治療

外泌體介導的干細胞與靶細胞之間的相互作用作為新的細胞間作用方式，可能為臨床治療POI提供新的策略。外泌體屬于細胞多泡體，是多泡體外膜與細胞膜融合后釋放到細胞外的一種直徑小于150nm的均一膜性囊泡，通過攜帶mRNA、miRNA、circRNAs、lncRNAs及蛋白質等信號分子，借助靶細胞內化、配體-受體相互作用或脂膜融合來完成鄰近或遠距離細胞間信號傳遞，進而發(fā)揮重要的生理或病理功能[13-14]。研究病變組織外泌體及其成分變化為發(fā)現新的疾病診斷標記物、探索新的發(fā)病機制以及開發(fā)新的治療措施提供可靠的技術手段和依據。

3.1 間充質干細胞來源外泌體 間充質干細胞是多能干細胞，優(yōu)點是容易獲得和免疫原性不完全，可來源于骨髓、臍帶、羊膜、脂肪等組織。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有來源方便、無倫理問題等優(yōu)點；缺點是對同種異體移植產生免疫反應及潛在的致瘤性[15]。而外泌體是較為合適的選擇：(1)與干細胞相比，安全，無致瘤傾向；(2)非免疫原性外泌體在體內耐受性好，循環(huán)半衰期長，免疫原性低[16]。Sun等[8]證實，BMSCs來源的外泌體(BMSCs derived exosomes，BMSCs-Exos)可改善卵巢早衰(premature ovrian failure，POF)小鼠的卵泡形態(tài)，抑制凋亡相關蛋白c-caspase 3、p53表達；與原代卵巢顆粒細胞(ovarian granulosa cells,OGCs)共培養(yǎng)，明顯抑制順鉑誘導的OGCs凋亡，改善卵泡衰竭和閉鎖，提高細胞活力。Yang等[7]發(fā)現，BMSCs-Exos移植顯著恢復POF大鼠的發(fā)情周期，增加始基卵泡和竇卵泡數，提高血清中E2和AMH水平，降低FSH、LH及caspase 3和caspase 9水平，緩解CTX所致的卵巢損傷。

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)表達了BMSCs的全部生物學特性，且具有良好的增殖分化潛能，臨床應用廣泛[17]。Sun等[18]研究表明，hUMSCs-Exos使順鉑組Bcl-2表達上調，bax、caspase-3和PARP表達下調以保護OGCs，提示hUMSCs-Exos體外預防和治療化療誘導的OGCs凋亡。Ding等[16]表明，hUMSCs-Exos增加POI小鼠OGCs及卵泡的增殖速率，降低凋亡率，且呈劑量依賴性。其分子機制主要是通過抑制CTX損傷的OGCs中SIRT7及下游靶基因的表達，從而恢復卵巢功能。同年該課題組首次發(fā)現人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)來源的外泌體(hAMSCs-Exos)能促進卵巢細胞增殖，降低OGCs和卵母細胞的SIRT4和ROS水平，并改善POI小鼠卵巢重量和產仔數[19]。Huang等[6]發(fā)現，人脂肪干細胞(human adipose mesenchymal stem cells，hADSCs)來源外泌體(hADSCs-Exos)可恢復化療損傷的卵巢功能，顯著促進卵泡增殖，抑制細胞凋亡，使相關激素E2、AMH、FSH水平升高至正常。此外，hADSCs-Exos通過激活SMAD抑制凋亡基因Fas、FasL、caspase-3和caspase-8的表達，表明其可通過調節(jié)SMAD通路來恢復POI患者卵巢功能。

3.2 羊水干細胞及羊膜上皮細胞來源外泌體 羊水干細胞(amniotic ?叢uid stem cells，AFSCs)來源于胚胎外層，是兼具胚胎干細胞和成人干細胞的多能干細胞，與間充質干細胞相比增殖更快。Xiao等[20]證明，AFSCs-Exos能抑制CTX所致OGCs的凋亡。人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cell，hAECs)保留了胚胎干細胞的特性，包括免疫調節(jié)、抗炎特性和低免疫原性[21]。由于這些有利的特點，hAECs已在再生醫(yī)學廣泛應用，在肺損傷、腦損傷和肝纖維化等移植治療后取得了良好的效果[22-23]。Zhang等[6]證實，hAECs-Exos能明顯抑制卵巢衰竭引起的OGCs凋亡，保護卵巢血管免受損傷，參與維持受損卵巢中原始卵泡數，改善卵巢功能。并通過KEEG和GO分析表明，hAECs來源的外泌體逆轉化療影響的某些生物學過程，包括棕色脂肪細胞分化、脂肪代謝過程或途徑、增殖物激活受體γ(PPARg)和AMP活化蛋白激酶信號途徑，同時該過程證實hAEC-Exos具有修復POF小鼠卵巢功能的潛力。

總之，某些干細胞來源的外泌體可改善化療所致POI/POF實驗動物的內分泌及生殖功能。但是由于外泌體提取需要耗費大量精力，并且純度及量不能達到預期，因此尋求外泌體中發(fā)揮作用的有效物質是新的突破點。

4 外泌體miRNA用于POI治療

4.1 外泌體轉運的miRNA miRNA是一類長度約為22～24個堿基的內源性單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物體內，并在進化上相對保守，通過與Agonaute一起結合在信使mRNA3'非編碼區(qū)(UTR)來調節(jié)基因的翻譯水平。miRNA有自己特異的結合靶位，在細胞增殖、分化、遷移、維持內穩(wěn)態(tài)以及凋亡中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[24]。miRNA的異常表達與多種疾病密切相關，如來自癌細胞的外泌體miR-205能調控血管生成和腫瘤的轉移[25]；miR-106a與卵巢發(fā)育密切相關，其表達下調可抑制卵巢癌細胞的生長和轉移[18]。近年miRNA與POI的研究逐漸增多，這些研究不僅證實了外泌體中miRNA對POI的治療作用，還探討驗證了相關機制。

4.2 外泌體miRNA治療POI Xiao等[20]發(fā)現，AFSCs-Exos來源的miR-10a可抑制OGCs凋亡，阻止化療后卵泡閉鎖，可能有助于卵泡的保存；hAEC-Exos來源的miR-1246和miR-21-5p過表達可顯著逆轉化療引起的凋亡蛋白caspase 3的表達[6]。另有研究證實huMSC-Exos來源的miR-644-5p分別通過調節(jié)靶基因PTEN、p53抑制受損的OGCs凋亡，抑制化療所致的卵巢衰竭[8]。2019年江蘇大學朱曉蘭課題組通過miR-144-5p抑制PTEN來改善化療導致的卵巢衰竭癥狀[7]。2020年Ding等[16]研究顯示，huMSCs-Exos通過激活 miR-17-5p 抑制SIRT7及其下游靶基因的表達改善POI患者的卵巢功能，卵巢總卵泡數量明顯增加，血清E2和AMH水平明顯升高，卵巢大小和重量明顯增加。進一步研究表明huMSCs-Exos通過遞送 miR-17-5p 抑制ROS的積累，并證實了外泌體 miR-17-5p 在人胚胎干細胞和卵母細胞中抑制活性氧水平的關鍵作用。同年，該課組研究發(fā)現hAMSCs-Exos的miR-320a可通過調控SIRT4蛋白表達誘導細胞增殖，維持卵巢功能進而改善POI[19]。兩項研究分別對huMSCs-Exos的 miR-17-5p、hAMSCs-Exos的miR-320a基因敲除，更為精準地研究了miRNA對POI的作用及機制，證明了外泌體miRNA可有效緩解POI。

5 精準研究外泌體miRNA

目前科學家對于miRNA分子功能的研究主要集中于患者病變組織和體外培養(yǎng)的細胞，而其在組織細胞發(fā)育和發(fā)病過程中的具體功能尚不明確[26]?；蚯贸Ｐ蜑榫珳恃芯縨iRNA的功能提供了重要的技術手段[27]。鑒于真核細胞的基因表達調控機制復雜，且miRNA在基因調控中起輔助作用，miRNA分子基因敲除基本上不表現出明顯的表型變化。在線蟲中，低于10%的miRNA分子敲除不會造成胚胎發(fā)育障礙或明顯的表型變化，且基因敲除對線蟲或小鼠造成的變化主要發(fā)生在壓力或損傷等應激狀態(tài)下[28]。基因敲除已為闡明miR-126[29]、miR-132[30]、miR-17-5p[16]、miR-320a[19]等分子的生理功能發(fā)揮了不可替代的作用。欲精準研究某一miRNA的生物學特性，可運用相關技術系統(tǒng)制備生殖細胞miRNA基因敲除模型及卵巢組織特異的基因敲除模型，從而研究某一miRNA基因敲除小鼠整體、卵巢生長發(fā)育狀況及組織反應，由此可精準推測出某一特定miRNA在改善POI方面是否有效。

6 展 望

化療所致POI患者恢復情況與化療藥的累計劑量和卵巢損傷程度有關，在化療后進行早期干預可使卵巢功能有一定程度的恢復。但是由于化療所致POI機制復雜多變，臨床上尚無有效的治療方法。研究證實，外泌體及其miRNA可顯著改善化療藥物所致POI的相關癥狀，其作用機制及安全性有待深入研究。探索外泌體及其miRNA與卵巢細胞的作用機制，有利于研發(fā)新的POI治療方法，改善POI患者的內分泌及生育功能。