田曼 祁正亮

鑒于結節(jié)性甲狀腺腫發(fā)病率逐年上升,相關實驗及臨床研究也日益受到重視,常用治療方案中理氣消癭方作為常用中藥湯劑,臨床治療中已取得一定應用效果,不過其具體藥物生效的分子機制尚未被闡明［1,2］。本文擬采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測PI3K/Akt 信號通路中分子蛋白的表達,從細胞內信號轉導層面,研究中藥理氣消癭方對PI3K/Akt 信號轉導途徑中相關分子表達的影響和內在規(guī)律,從而闡明其治療結節(jié)性甲狀腺腫的作用機制,進一步為其臨床推廣應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 大鼠信息 Wist-ar 雄性大白鼠60 只,自湖北疾病控制中心處購得,許可證號為SCXK(鄂)2015-0018,大鼠平均體重為(223.52±10.25)g。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 北京大龍控股有限公司聲場的微量移液器,ABI 公司提供的QuantStudio 6 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司提供的EDC-810 型PCR 儀。

1.2.2 處理方法 將60 只大鼠以隨機數字法分為空白對照組、消癭方組、模型組、優(yōu)甲樂組,每組15 只,實驗前置于同一室內環(huán)境下飼喂,室溫控制在20℃,恒濕50%。

1.2.2.1 造模 大鼠飼喂14 d 后開始造模,除空白對照組外其余3 組小鼠均給予濃度為0.1%的丙基硫氧嘧啶(PTU)溶液,早晨灌胃1 次,持續(xù)灌服8 周,利用多普勒超聲完成造模檢查,確定造模成功后開始后續(xù)試驗［3］。

1.2.2.2 給藥 空白對照組：堅持每日進行普通胃喂養(yǎng)并給予生理鹽水灌胃,2 次/d,灌胃2～3 ml/次。模型組：完成造模后同樣給予生理鹽水灌胃,方案與空白對照組一致。優(yōu)甲樂組：給予優(yōu)甲樂(深圳市中聯制藥有限公司,國藥準字H20010522)溶液灌服,濃度0.1 mg/L,1 ml/100 g。消癭方組：給予活血消癭方(湖北省中醫(yī)院藥劑科,批號：鄂藥科試劑Z20090005)灌服,組方為：柴胡、青皮、橘葉、郁金、蜣螂蟲、細辛、三棱、白芥子、萊菔子、瓜蔞皮,每片含生藥0.45 g,將藥碾末后傾入離心管,加Milli-Q 純水振蕩混勻配制成15%混懸液,灌服給予濃度為88 g/L 的理氣消癭方溶液,灌服,1 次/d,持續(xù)灌服8 周。

1.2.3 標本獲取 完成最后1 次干預后禁食12 h、禁飲2 h,給予常規(guī)麻醉后固定于鼠臺,切開大鼠頸部皮膚,暴露氣管后找到兩側甲狀腺,分離周圍組織后取部分甲狀腺組織,保存在2 ml 凍藏管內,并放入冰箱備用,溫度為-20℃。

1.2.4 RT-PCR 檢測 ①PI3K 引物順序為：5'-GC TCTTCTTCCACCTGTCTCG-3'/5'-CACAGCCCGAAGT CCGTTA-3',擴增產物大小為176 bp,Akt 引物順序為：5'-TGAGACCGACACCAGGTATTTTG-3'/5'-GCTGAG TAGGAGAACTGGGGAA-3',擴增產物大小為135 bp［4］。Tunel 試劑盒及配套試劑(Roche,貨號11681817910),DAB顯色劑(DAKO,貨號K5007)。②RNA 獲?。?3000 r/min完成離心,離心時間10 min,后續(xù)加入250 μl 氯仿,震蕩離心管15 s 后孵育3 min,再以相同轉速離心8 min,轉移上清液至新離心管內,加入0.8 倍體積異丙醇,孵育15 min,再度離心10 min,獲得RNA。③反轉錄：取PCR 管,加入總RNA 2 μg,加入去離子水10 μl,并置入dT 18 μl,混合均勻后完成離心,冷卻后加入反應試劑,在42℃條件下孵育60 min,給予80℃加熱,持續(xù)5 min 終止反應。取0.5 ml PCR 管,逐次加入試劑并完成PCR 擴充,使用△△CT 法完成結果處理。

1.3 觀察指標 比較四組大鼠 PI3K、Akt 信號通路分子表達量以及1 個月內存活情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組PI3K 信號通路分子表達量比較 空白對照組PI3K 信號通路分子表達量為(1.00±0.01)低于模型組的(1.52±0.07)、優(yōu)甲樂組的(1.41±0.07)、消癭方組的(1.31±0.08),差異均具有統(tǒng)計學意義(t=28.482、22.457、14.892,P＜0.05)。消癭方組PI3K 信號通路分子表達量明顯低于模型組及優(yōu)甲樂組,差異均有統(tǒng)計學意義(t=7.651、3.643,P＜0.05)。

2.2 四組Akt 信號通路分子表達量比較 空白對照組Akt 信號通路分子表達量為(1.00±0.01)低于模型組的(2.14±0.08)、優(yōu)甲樂組的(2.01±0.03)、消癭方組的(1.67±0.07),差異均具有統(tǒng)計學意義(t=54.764、123.70、36.697,P＜0.05)。消癭方組Akt 信號通路分子表達量均低于模型組、優(yōu)甲樂組,差異均具有統(tǒng)計學意義(t=17.124、12.388,P＜0.05)。

2.3 四組大鼠存活情況比較 空白對照組存活15 只,存活率為100.00%；模型組存活5 只,存活率為33.33%；優(yōu)甲樂組存活8 只,存活率為53.33%；消癭方組存活15 只,存活率為100.00%?？瞻讓φ战M小鼠存活率100.00%明顯高于模型組的33.33%、優(yōu)甲樂組的53.33%,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；空白對照組與消癭方組大鼠存活率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

甲狀腺腫屬于常見甲狀腺疾病。觸診和高分辨率超聲檢查發(fā)現的人群甲狀腺結節(jié)患病率分別為3%～7%和20%～76%［5］。甲狀腺單發(fā)結節(jié)患病率為11.6%,甲狀腺多發(fā)結節(jié)發(fā)病率為7%,近年來,此病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,而臨床上也越來越多見其與甲狀腺癌并存的報道。

當前本病的研究分析認為細胞異常凋亡/增生在甲狀腺腫發(fā)生中起到了重要作用。在部分學者的研究中發(fā)現,甲狀腺腫合并有增生結節(jié)的患者其P27 表達量明顯高于甲狀腺癌及單純甲狀腺腫患者,提示患者病灶處于細胞增殖階段,因而猜測結節(jié)性甲狀腺腫存在一定惡變轉化能力。而在人TNF 相關凋亡誘導配體(TRALL)檢測中有學者發(fā)現,甲狀腺癌與結節(jié)性甲狀腺腫患者TRALL 陽性表達率較正常人冥想更高,推測細胞的增生與凋亡關系失衡為也可能為本病發(fā)展的重要因素。

在分子調控機制的研究中指出,PI3K/Akt 信號通路可對機體細胞的增殖、凋亡進行調控,其中Akt 能夠有效利用磷酸化絲氨酸等對細胞的存活及增殖產生影響,其主要利用激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其相應下游途徑完成特殊蛋白翻譯,促成細胞增殖。該分子通路可激活P70S6K,完成核糖體蛋白mRNA 翻譯,另外也可通過促進4E-BP-1 進一步完成磷酸化,達到增加mRNA 轉錄的效果,繼而對蛋白質合成產生調控作用。PI3K/Akt 信號通路均可抑制4E-BP-1 表達,達到調控細胞增殖的效果,此外還可對P21、P27 的表達進行抑制,對G1期進程起到加速作用,促使細胞分化。在細胞凋亡過程中,PI3K/Akt 信號通路可通過抑制Forkhead 家族轉錄因子活性對BAD的多種物質進行磷酸化,阻斷P53,調節(jié)NF-κB,上調凋亡抑制因子(IAPs)表達等充分對細胞凋亡產生抑制。就本次研究結果顯示,空白對照組PI3K 信號通路分子表達量低于模型組、優(yōu)甲樂組、消癭方組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？瞻讓φ战MAkt 信號通路分子表達量低于模型組、優(yōu)甲樂組、消癭方組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明在結節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)生與PI3K/Akt 信號通路表達上調有直接關聯。

臨床結節(jié)性甲狀腺腫治療中常用優(yōu)甲樂為常用藥物,其主要通過增加機體蛋白酶的合成及酶活性影響患者細胞增殖發(fā)育達到治療目的,但臨床應用中存在一定局限性。結節(jié)性甲狀腺在中醫(yī)學上歸屬于“結癭”范疇,結節(jié)性甲狀腺腫以正氣虧虛為發(fā)病內因,誘因為情志失調,高發(fā)原因為飲食起居失常,在整個發(fā)病過程中痰瘀貫穿其中,作為一個病理環(huán)節(jié)極為重要,也極易導致該病反復復發(fā)和遷延難愈,結節(jié)性甲狀腺腫痰血瘀阻不但具備痰瘀的特點,而且呈現自身特點,以甲狀腺結節(jié)、甲狀腺局部疼痛、甲狀腺腫大等為主要臨床表現。消癭方由柴胡、青皮、橘葉、郁金、蜣螂蟲等多種中藥材組合而成,主要用于活血化瘀,組方內郁金可活血止痛、行氣解郁；柴胡疏肝破氣,消積化滯；橘皮理氣健脾、燥濕化痰；細辛祛風止痛；三棱破血行氣、降氣化痰；萊菔子消積止痛、消食除脹；蜣螂蟲活血止痛；瓜蔞皮清化熱痰,利氣寬胸；柴胡具有升舉陽氣之效,多藥合用于本病治療中效果明顯,已為臨床驗證。經本次大鼠實驗發(fā)現,消癭方組PI3K/Akt信號通路分子表達量均明顯低于模型組及優(yōu)甲樂組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？瞻讓φ战M小鼠存活率100.00%明顯高于模型組的33.33%、優(yōu)甲樂組的53.33%,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；空白對照組與消癭方組大鼠存活率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。猜測本方可抑制PI3K/Akt 信號通路激活達到調控患者細胞凋亡/增殖的目的,繼而對本病起到一定治療效果。

在胡根等［5］的研究中同樣進行分組研究,發(fā)現模型鼠的PI3K/Akt 信號通路分子表達量較空白對照組明顯更高,而應用消癭方治療的大鼠PI3K/Akt 信號通路分子表達量較常規(guī)西藥治療及模型鼠明顯更低。本次研究與其研究存在一定相似性。

綜上所述,消癭方用于結節(jié)性甲狀腺腫治療中可通過抑制PI3K/Akt 信號通路的激活,達到治療目的。