喬國棟，王永紅

中性粒細(xì)胞一旦發(fā)現(xiàn)異物或內(nèi)源性威脅，就會采取一系列措施，包括吞噬和產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）等，確保消除危害。中性粒細(xì)胞還可以產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子來警告附近的其他細(xì)胞，從而使宿主的免疫反應(yīng)最大化。除此之外，中性粒細(xì)胞另一種防御方式是形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）來捕獲病原體，中性粒細(xì)胞首先通過排出核和線粒體DNA來固定細(xì)菌，然后通過釋放組蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白酶殺死細(xì)菌，并等待巨噬細(xì)胞吞噬。NETs除了在免疫防御中的功能外，在炎癥、自身免疫和其他病理生理狀況中也起著重要的作用[1]，如子癇前期（preeclampsia，PE）發(fā)病主要與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等有關(guān)，通過調(diào)控NETs的表達(dá),可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，被認(rèn)為是子癇前期患者血管內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 NETs概述

2004年Brinkmann等[2]首次提出了NETs的概念，描述了中性粒細(xì)胞在激活后釋放了顆粒蛋白和染色質(zhì)，一起構(gòu)成了NETs。NETs的主要成分是核DNA和組蛋白，其次是顆粒酶和肽。其蛋白包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和肽聚糖結(jié)合蛋白等[3]。Yousefi等[4]研究表明，由活細(xì)胞形成的NETs包含線粒體DNA，但沒有核DNA。通過阻止ROS產(chǎn)生的方法表明，NETs的形成依賴于ROS，這種現(xiàn)象同樣存在于嗜酸性粒細(xì)胞中。Stojkov等[5]研究表明，抑制細(xì)胞骨架動力學(xué)可阻止中性粒細(xì)胞脫粒和形成NETs所需的線粒體DNA釋放，解釋了細(xì)胞骨架動力學(xué)在構(gòu)成NETs中發(fā)揮的重要作用。

目前，NETs的釋放主要被視為是由外部刺激激活的細(xì)胞內(nèi)在途徑驅(qū)動的活躍過程[6]。Tatsiy等[7]研究表明，N-甲?；?甲硫?；?苯丙氨酸（N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP）、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）均為有效的誘導(dǎo)劑。白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）也是很好的誘導(dǎo)劑，但其誘導(dǎo)效果相對較弱。某些中性粒細(xì)胞活化劑，如白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ），幾乎不誘導(dǎo)NETs形成，這表明并非所有中性粒細(xì)胞刺激物都是NETs誘導(dǎo)劑。

中性粒細(xì)胞活化后會產(chǎn)生大量的ROS，這些氧可通過與Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）結(jié)合導(dǎo)致中性粒細(xì)胞核膜的裂變。細(xì)胞內(nèi)的NE和MPO通過中性粒細(xì)胞核膜的分裂遷移到細(xì)胞核，在那里它們部分降解特定的組蛋白并促進染色質(zhì)的縮聚[8]。由肽基絲氨酸精氨酸脫亞氨酶4（peptidylserine arginine deaminase 4，PAD4或PADI4）誘導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化進一步促進染色質(zhì)縮聚[9]。在此過程中導(dǎo)致PAD4激活的確切機制仍然未知。染色質(zhì)去濃縮后，松散的染色質(zhì)與顆粒狀細(xì)胞質(zhì)和各種蛋白質(zhì)混合，然后全部被送出細(xì)胞外空間，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2 NETs形成相關(guān)的活性因子

2.1 NADPH氧化酶Fuchs等[10]研究表明，由于慢性肉芽腫?。╟hronic granulomatous disease，CGD）患者NADPH氧化酶的突變，患者的中性粒細(xì)胞在PMA激活后均不能產(chǎn)生ROS，使用ROS抑制劑和從CGD患者中分離出的中性粒細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明，需要NADPH氧化酶來觸發(fā)最終形成NETs的信號。通過NADPH氧化酶生成的ROS不僅是中性粒細(xì)胞死后殺死微生物的必需分子，還要充當(dāng)?shù)诙攀箒碛|發(fā)NETs的形成。在活細(xì)胞成像監(jiān)測下證實，PMA或細(xì)菌誘導(dǎo)的NETs形成途徑中，中性粒細(xì)胞是通過NADPH氧化酶依賴性機制將蛋白修飾的核DNA釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。Nadesalingam等[11]研究表明，高滲氯化鈉（NaCl）會抑制由誘導(dǎo)劑PMA、大腸桿菌（Escherichia col，E.coli）和銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的NADPH氧化酶的中性粒細(xì)胞形成NETs。高滲鹽水還抑制E.coil和PMA誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。在補充過氧化氫（H2O2）后，逆轉(zhuǎn)了高滲鹽水對依賴NADPH氧化酶的中性粒細(xì)胞形成NETs的抑制作用。Wang等[12]研究表明，在高葡萄糖誘導(dǎo)NETs形成的過程中，ROS水平顯著升高，證明了NADPH氧化酶激活的參與。二苯基氯化碘鹽（diphenylene iodonium chloride，DPI）成功抑制了高糖誘導(dǎo)的NETs的形成，表明NETs的形成依賴ROS，高葡萄糖誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs依賴NADPH氧化酶。

2.2 中性粒細(xì)胞NE和MPO中性粒細(xì)胞激活后，NE從嗜銅顆粒中逸出并易位至細(xì)胞核，在其中降解特定的組蛋白，與MPO協(xié)同促進染色質(zhì)的縮聚。Zabieglo等[13]研究表明，外源性和內(nèi)源性的分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）都是中性粒細(xì)胞形成NETs的有效負(fù)調(diào)節(jié)劑，可對感染和炎癥刺激[如金黃色葡萄球菌TNF-α或誘導(dǎo)劑PMA]作出反應(yīng)，通過抑制NE的生成減少NETs的釋放。

Bj?rnsdottir等[14]研究表明，胞外ROS的完全中和不足以阻止PMA觸發(fā)NETs的形成，這表明胞內(nèi)ROS對于NETs的形成至關(guān)重要。使用MPO抑制劑對NETs形成的抑制與抑制胞內(nèi)MPO的活性有關(guān)，胞外添加MPO不能使完全缺乏MPO的中性粒細(xì)胞形成NETs，并且在細(xì)胞內(nèi)由于使用MPO處理過的ROS和魯米諾特異性中和作用導(dǎo)致PMA觸發(fā)了NETs形成的完全阻斷反應(yīng)。Odobasic等[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MPO的中性粒細(xì)胞可形成NETs且不能通過添加MPO的細(xì)胞外產(chǎn)物來影響NETs形成，這表明MPO可以在細(xì)胞中自主發(fā)揮作用；另一方面，與NETs結(jié)合的MPO對樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的刺激可導(dǎo)致MPO特異性自身免疫產(chǎn)生和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）血管炎的發(fā)展。

2.3 PAD4在探究中性粒細(xì)胞染色質(zhì)縮聚的過程中，PAD4已經(jīng)被證實可通過催化組蛋白瓜氨酸化介導(dǎo)染色質(zhì)縮聚。Wong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PAD4介導(dǎo)精氨酸向瓜氨酸轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致組蛋白中精氨酸殘基的正電荷大量損失，降低了DNA和組蛋白之間的作用力，從而促進了染色質(zhì)縮合。染色質(zhì)濃縮過程取決于PAD4的酶活性和足夠的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，PAD4的過度表達(dá)會以與NETs類似的方式在非粒細(xì)胞中引起廣泛的染色質(zhì)濃縮。Gordon等[17]研究表明，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）和增生性腎炎的小鼠模型中，PAD4的缺失對自身免疫反應(yīng)和靶器官的損傷并沒有任何改善，而且在兩種獨立的ICFcγR介導(dǎo)的腎小球腎炎模型中，使用N-α-苯甲酰基-N5-（2-氯-1-亞氨基乙基）-L-鳥氨酸酰胺抑制PAD對中性粒細(xì)胞的聚集或腎小球損傷都沒有影響。Guiducci等[18]研究表明，盡管白色假絲酵母菌很容易誘導(dǎo)PAD4介導(dǎo)中性粒細(xì)胞組蛋白瓜氨酸化，但對于白色假絲酵母菌菌絲誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生的過程PAD4并不是必須的。缺乏PAD4的中性粒細(xì)胞具有吞噬細(xì)胞的正常能力并響應(yīng)菌絲產(chǎn)生ROS，在體外具有抗真菌活性。而且，對于在黏膜和全身性白色假絲酵母菌感染期間抗真菌能力的產(chǎn)生也不是必需的。

2.4 自噬性溶酶體最新的研究表明自噬性溶酶體與NETs的形成有密切關(guān)系。Sharma等[19]研究表明，自噬性溶酶體和ROS的產(chǎn)生是PMA有效誘導(dǎo)NETs形成的必要條件。抑制自噬性溶酶體或NADPH氧化酶的作用均能阻止染色質(zhì)的縮合，這對于NETs的形成至關(guān)重要。Sil等[20]研究表明，痛風(fēng)患者中性粒細(xì)胞的活化與NETs的形成有關(guān)，并且該過程與自噬性溶酶體和IL-1β有關(guān)。Itakura等[21]研究表明，藥理抑制劑對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性的阻斷會增加自噬性溶酶體的活性，并促使中性粒細(xì)胞形成NETs。mTOR和細(xì)胞骨架機制在調(diào)節(jié)人中性粒細(xì)胞內(nèi)自體吞噬介導(dǎo)的NETs形成中起關(guān)鍵作用。Xue等[22]研究表明，大腸桿菌O157：H7誘導(dǎo)的蛋白激酶A（PKA）激活抑制了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular-signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）激活，并增強了磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號傳導(dǎo)，從而抑制了自噬信號傳導(dǎo)。相反，PKA抑制可防止由于大腸桿菌O157:H7感染而導(dǎo)致ERK1/2信號下調(diào)。Ma等[23]研究表明，藥理抑制劑或抗自噬相關(guān)基因7（autophagyrelated gene 7，ATG7）的小分子干擾RNA可抑制自噬性溶酶體的形成并顯著降低中性粒細(xì)胞的NETs生成。Xu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，老年人ATG5的表達(dá)水平降低可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在TLR2刺激后形成NETs的能力降低，表明自噬性溶酶體在維持NETs機制具有重要作用。Teimourian等[25]研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路是自噬性溶酶體的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過調(diào)控10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（PTEN）的表達(dá)來影響PI3K/AKT/mTOR通路進而影響中性粒細(xì)胞NETs的生成。但也可能存在其他調(diào)控自噬性溶酶體的途徑。

3 NETs形成涉及的信號通路

3.1 Raf-ERK激酶-p38有絲分裂原活化蛋白激酶（Raf-MEK-p38MAPK）信號通路Fonseca等[26]研究表明，溶組織內(nèi)阿米巴通過Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)NETs形成。Grimberg-Peters等[27]研究表明，PMA誘導(dǎo)NADPH氧化酶的激活以產(chǎn)生ROS，然后刺激細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular-signal regulated kinase，ERK）和磷酸化誘導(dǎo)NETs的形成。

Alemán等[28]研究表明，中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生許多介質(zhì)而影響先天性和適應(yīng)性免疫，這些介質(zhì)的調(diào)節(jié)主要取決于核因子κB抑制蛋白激酶/核因子κB抑制蛋白/核因子κB（IKK/IκB/NF-κB）信號級聯(lián)。在刺激中性粒細(xì)胞活化時，阻斷活化激酶1（activated kinase 1，TAK1） 的活性可減弱細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)IKKα/β的磷酸化，并削弱IκB-α的降解和活化嗜中性粒細(xì)胞中NF-κB DNA的結(jié)合。TAK1參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和ERK的激活，這也影響嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞因子的生成。

Ma等[29]研究表明，豬鏈球菌血清型2（streptococcus suis serotype 2，SS2）在2～4 h內(nèi)可誘導(dǎo)生成NETs，并且依賴于NADPH氧化酶的活性氧，血細(xì)胞中SS2感染顯著上調(diào)了TLR2和TLR4，說明這兩個受體與SS2識別有關(guān)。阻斷TLR4信號傳導(dǎo)可進一步抑制ERK1/2的激活，但不能抑制p38MAPK的激活。TLR4信號抑制了SS2誘導(dǎo)NETs的形成。SS2可以被TLR2和（或）TLR4識別，以NADPH氧化酶衍生的ROS依賴性方式啟動NETs形成信號通路。ROS將激活p38MAPK和ERK1/2，最終誘導(dǎo)NETs的形成?；罨膒38MAPK可能不是SS2誘導(dǎo)的NETs釋放過程中的關(guān)鍵分子，或者可能是增強SS2誘導(dǎo)的NETs形成能力的附加信號途徑。SS2誘導(dǎo)的NETs形成中p38MAPK和ERK1/2的關(guān)系需要進一步研究。

3.2 蛋白酪氨酸激酶（PTK）信號通路Nanì等[30]研究表明，β-葡聚糖顆粒內(nèi)化后與NETs形成有關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑與蛋白酪氨酸激酶非受體型Src家族的Syk激酶和ROS有關(guān)。β-葡聚糖顆粒在酪氨酸殘基中觸發(fā)了非受體型Lyn激酶和Hck激酶的磷酸化，酪氨酸殘基的磷酸化與激酶活性有關(guān)。鼠類缺乏Syk的中性粒細(xì)胞的激活機制表明，Syk在觸發(fā)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌以及免疫復(fù)合物形成NETs的過程中起重要作用，在缺乏Syk的中性粒細(xì)胞中，β-葡聚糖顆粒內(nèi)化是不完整的，進一步表明Syk通過響應(yīng)不同誘導(dǎo)劑而調(diào)節(jié)NETs形成。Silva等[31]研究表明，煙曲霉誘導(dǎo)的NETs釋放依賴于蛋白酪氨酸激酶Src家族Syk的活性。盡管煙曲霉促進了組蛋白瓜氨酸化，但是該過程對于煙曲霉分生孢子的NETs釋放是必不可少的。煙曲霉誘導(dǎo)的NETs釋放需要NADPH氧化酶復(fù)合物生成活性氧，在下游途徑中需要蛋白酪氨酸激酶Src家族Syk的活性。

3.3 受體相互作用蛋白激酶1-受體相互作用蛋白激酶3-混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白（RIPK1-RIPK3-MLKL）信號通路Torene等[32]研究表明，TNF誘導(dǎo)凋亡涉及PI3Ks，p38MAPK激活。TNF誘導(dǎo)的PI3K活化導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）基因這一機制在沒有活性NADPH氧化酶的中性粒細(xì)胞中不起作用。在中性粒細(xì)胞中，腫瘤壞死因子受體（tumour necrosis factor receptor 1，TNFR1）刺激后的促凋亡途徑是由p38MAPK和PI3K啟動的。Desai等[33]研究表明，人類和鼠類中性粒細(xì)胞在接觸尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）、草酸鈣一水合物、磷酸鈣、膽固醇、胱氨酸、二氧化硅和石棉后出現(xiàn)凋亡并形成NETs。在抑制劑抑制了RIPK1和MLKL的活性后，MSU晶體或PMA不能誘導(dǎo)人和小鼠的中性粒細(xì)胞形成NETs。這些抑制劑不影響PMA或尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的活性氧生成。慢性肉芽腫患者中性粒細(xì)胞缺乏PMA誘導(dǎo)的MLKL磷酸化。小鼠RIPK3基因缺陷可在體內(nèi)外阻止MSU晶體誘導(dǎo)的NETs形成。中性粒細(xì)胞的死亡和NETs的形成可能涉及RIPK1-RIPK3-MLKL信號傳導(dǎo)途徑。提示RIPK1、RIPK3和MLKL可能是痛風(fēng)或其他晶體病的分子靶點。

4 NETs與生殖相關(guān)疾病

Gomez-Lopez等[34]研究表明，在羊膜內(nèi)存在感染的患者羊水中，羊水內(nèi)的中性粒細(xì)胞形成了NETs。所有羊水樣本中都有可檢測到的與NETs有關(guān)的活細(xì)菌和死細(xì)菌，與母體循環(huán)產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞相反，羊水中性粒細(xì)胞不需要PMA刺激即可形成NETs，通過將彈性蛋白酶，組蛋白H3和DNA共定位在羊水中性粒細(xì)胞中可以觀察到NETs形成的不同階段。這一發(fā)現(xiàn)為羊水內(nèi)中性粒細(xì)胞殺死侵入羊膜腔的微生物提供了一種新的免疫防御機制。Hu等[35]研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞微粒（microparticles，MPs）是子癇前期患者體內(nèi)NETs生成的主要刺激物。結(jié)合之前已經(jīng)報道的低氧胎盤中促炎蛋白與母體內(nèi)皮損傷和MPs產(chǎn)生有關(guān)，證實來自缺氧胎盤的促炎蛋白刺激母體內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MPs，進而在母體循環(huán)中誘導(dǎo)NETs生成。高水平的NETs會促進血液凝結(jié)，進而促成子癇前期患者常見的高凝狀態(tài)。這些研究應(yīng)有助于確定靶向中性粒細(xì)胞活化是否可以作為預(yù)防或治療子癇前期血栓形成的治療策略。Barr等[36]研究表明，用HIV病毒樣顆粒（HIV-VLP）刺激女性生殖道中性粒細(xì)胞可在病毒暴露后的幾分鐘內(nèi)誘導(dǎo)NETs的釋放，通過不依賴ROS的機制立即捕獲HIV-VLP，將感染性HIV與預(yù)先在生殖道中形成的NETs一起培養(yǎng)可造成病毒不可逆失活。表明NETs可迅速攔截和滅活HIV且不可逆，是防止性接觸后黏膜細(xì)胞感染HIV的有效機制。在女性生殖道中NETs滅活HIV可能代表了黏膜保護在預(yù)防HIV感染的一種前所未有的形式。

5 結(jié)語

NETs的形成涉及到了多種信號途徑和多種細(xì)胞因子或介質(zhì)，在內(nèi)環(huán)境中處于復(fù)雜的相互影響和調(diào)控狀態(tài)。NETs形成過程中相關(guān)的分子、受體和通路等，已經(jīng)被視為多種臨床疾病的治療靶標(biāo)，進一步了解NETs的具體形成機制為臨床早期預(yù)測生殖相關(guān)疾病的發(fā)生和選擇治療的靶點提供一定的理論依據(jù)。