賈立云，封紀(jì)珍，王熙，馬翠霞，封露露

Citrin蛋白缺乏癥是一類常染色體隱性遺傳病，由SLC25A13基因突變所致，引起肝細(xì)胞線粒體Citrin蛋白功能不足，導(dǎo)致機體代謝紊亂[1]。該病臨床罕見，發(fā)病機制目前尚不完全清楚，臨床上將其分為兩類：一類為新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD），由Citrin蛋白缺乏所致；另一類為成年發(fā)作Ⅱ型瓜氨酸血癥（citrullinaemia type Ⅱ，CILN2）[2]。Citrin蛋白缺陷所致的NICCD最常見，新生兒期主要表現(xiàn)為膽汁淤積、黃疸延遲消退、凝血功能障礙、肝功能異常以及血氨基酸水平升高。NICCD患兒預(yù)后較好，多數(shù)患兒1歲以內(nèi)可恢復(fù)正常，少數(shù)患兒因延遲就醫(yī)而發(fā)生肝功能衰竭[3-5]。自2013年串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)不斷在新生兒遺傳代謝病篩查中推廣應(yīng)用，使患兒得以早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，我國部分地區(qū)已經(jīng)將NICCD列為篩查病種之一，然而此病部分患兒呈現(xiàn)假陰性[6-7]。本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對石家莊地區(qū)2014—2019年出生的160 061例活產(chǎn)新生兒進行氨基酸水平檢測，初步明確了該病在石家莊地區(qū)的患病率，進而對部分患兒進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)了1種未報道過的SLC25A13基因突變位點。

1 資料與方法

1.1一般資料采集石家莊地區(qū)2014年1月—2019年12月分娩的160 061例活產(chǎn)新生兒（3～20 d） 的足跟血，制成S&S903濾紙干血斑標(biāo)本，經(jīng)石家莊市新生兒疾病篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜篩查并進一步確診的1例Citrin蛋白缺乏癥患兒以及1例假陰性患兒。篩查前家長均簽署知情同意書，本研究經(jīng)石家莊市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.2檢測方法

1.2.1 儀器與試劑 串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQD，Waters）、自動進樣器（2777C）、高效液相色譜儀泵（1525）、串聯(lián)質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)分析軟件（MassLynxV4.1）均購自美國Waters公司；超聲波清洗機購自中國康士潔有限公司；通風(fēng)柜購自中國杰瑞電氣有限公司；微孔板恒溫孵育震蕩儀購自杭州奧盛儀器有限公司；串聯(lián)質(zhì)譜-非衍生化氨基酸測定試劑盒購自山東英盛公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 生后72 h，充分哺乳后于新生兒足跟內(nèi)、外側(cè)緣用75%的乙醇棉簽消毒后，采用觸壓式采血器穿刺，深度不超過2.0 mm，用無菌棉球棄去第一滴血，連續(xù)采集3個血滴于S&S903濾紙，每個血斑的直徑不小于8 mm，以水平位置懸掛血片，室溫下自然干燥2～3 h后，血斑顏色從鮮紅至褐色即可遞送，如不能當(dāng)日進行遞送，應(yīng)將血片標(biāo)本置于密封袋中，置于2～8 ℃冰箱，最遲不超過5個工作日遞送至篩查中心。

1.2.3 檢測方法 采用串聯(lián)質(zhì)譜干血濾紙片——非衍生法。①萃取：用打孔器從標(biāo)本上打出直徑3 mm的血斑，置于96孔微孔板中。使用校準(zhǔn)的移液器，將90 μL萃取工作液依次加入到標(biāo)本孔中，貼上封片以減少蒸發(fā)，30 ℃，700 r/min，于恒溫震蕩孵育器震蕩45 min。②上機：取出96孔板，移液75 μL至V型底96孔板，鋁箔紙覆上，減少揮發(fā)，置于2777C自動進樣器中；MassLynxV4.1中建立樣品列表，沖洗管路后進樣分析。③濃度值計算：通過比較分析物及內(nèi)標(biāo)的信號積分面積，計算待檢物質(zhì)的濃度水平。

1.2.4 質(zhì)量控制 每批實驗均設(shè)置高、低質(zhì)控，質(zhì)控來源為山東英盛氨基酸和肉堿測定試劑盒自帶商品化高、低質(zhì)控。每次檢測過程中將室內(nèi)質(zhì)控品與樣本同時檢測，記錄此標(biāo)本的檢測結(jié)果；計算前20次檢測結(jié)果的平均值作為本批質(zhì)控品的靶值，質(zhì)控結(jié)果控制在靶值±2SD內(nèi)；每年參加2次國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心的室間質(zhì)量評價，成績合格。

1.2.5 診斷方法

1.2.5.1 確診 串聯(lián)質(zhì)譜篩查血瓜氨酸水平≥30 μmol/L為篩查陽性，召回復(fù)查陽性患兒進行生化檢測，顯示總蛋白、白蛋白明顯降低；堿性磷酸酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、膽汁酸、總膽紅素、直接膽紅素升高；甲胎蛋白＞1 000 μg/L；尿有機酸水平顯著升高。肝性和膽汁淤積性黃疸，直接膽紅素、血瓜氨酸升高為主要臨床特征。以SLC25A13基因檢測到突變?yōu)榛虼_診。

1.2.5.2 基因檢測 疑似患兒經(jīng)知情同意，采集患兒及父母外周靜脈血各4 mL，采用DNA提取試劑盒（Qiagen）提取核酸，后進行基因組文庫構(gòu)建。用標(biāo)記的探針抓取目的基因，用磁力架吸附，富集目的基因。采用Illumina公司的NextSeq 500進行代謝相關(guān)基因測序[8]。檢測到的變異位點嚴(yán)格按照ACMG指南進行致病性分析。未報道的基因突變，則用生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件預(yù)測致病性，進一步采用Sanger測序進行結(jié)果驗證。此檢測由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗所完成。

2 結(jié)果

2.1總體篩查情況160 061例新生兒中篩查陽性20例，確診1例，另1例患兒篩查未能檢出，呈現(xiàn)假陰性，患兒不足1個月因皮膚黃染加重入院，查血串聯(lián)質(zhì)譜，顯示瓜氨酸和甲硫氨酸升高；Citrin蛋白缺乏癥在石家莊地區(qū)新生兒中的患病率為2/160 061。

2.2串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果2例Citrin蛋白缺乏癥患兒中，例1初篩結(jié)果瓜氨酸（CIT）水平稍高于參考值范圍（4～30 μmol/L），為44.00 μmol/L，復(fù)查時CIT為504.00 μmol/L，甲硫氨酸（MET）58.60 μmol/L（參考值8～50 μmol/L）；例2初篩結(jié)果CIT在正常參考范圍以內(nèi)，為17.17 μmol/L，未做復(fù)查。

2.3基因突變檢測結(jié)果2例患兒中只有1例患兒進行基因檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)為SLC25A13基因復(fù)合雜合突變，見圖1，分別來自父母，其中c.1021+1G＞A為剪切位點突變，為未見報道突變，使用GERP++、SIFT、REVEL、PolyPhen_2、MutationTaster等生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件，預(yù)測其致病性，結(jié)合患兒皮膚黃染加重，血串聯(lián)質(zhì)譜顯示瓜氨酸和甲硫氨酸升高，尿有機酸氣相質(zhì)譜顯示4-羥基苯乳酸及4-羥基苯丙酮酸均顯著升高，考慮為致病性變異；c.851_854delTATG為缺失突變，造成移碼突變，編碼2個氨基酸后終止，見表1。

圖1 例1患兒的SLC25A13基因突變檢測結(jié)果

表1 Citrin蛋白缺乏癥患兒基因突變檢測結(jié)果

3 討論

3.1 Citrin蛋白缺乏癥在石家莊地區(qū)新生兒中的患病率Citrin蛋白缺乏致NICCD是尿素循環(huán)障礙旁路代謝異常疾病，在新生兒期主要有黃疸消退減慢、膽汁淤積等臨床表現(xiàn)，如未能明確病因，會延誤診治，影響患兒預(yù)后[9]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在新生兒疾病篩查中的不斷推廣應(yīng)用，使早期發(fā)病的Citrin蛋白缺乏癥患兒得以篩查、確診和及時干預(yù)治療[10-11]。據(jù)文獻報道，該病在韓國的患病率為1/50 000，日本為1/19 000，我國的患病率為1/17 000[12]。文獻報道該病在廣州市新生兒中患病率為1/22 664[6]。本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對160 061例新生兒進行篩查，回顧分析發(fā)現(xiàn)Citrin蛋白缺乏癥在石家莊地區(qū)新生兒中的患病率為2/160 061，低于廣州市新生兒患病率，可能與南北地區(qū)人群的SLC25A13基因突變雜合子攜帶率不同相關(guān)，具有地域性差異，有待進一步分析。

3.2 部分Citrin蛋白缺乏癥篩查呈假陰性本研究檢出1例患兒，串聯(lián)質(zhì)譜篩查和瓜氨酸增高對明確診斷NICCD有重要意義。此外篩查發(fā)現(xiàn)1例呈假陰性，據(jù)文獻報道廣州市158 651例新生兒中發(fā)現(xiàn)4例患兒呈假陰性[6]。因此，新生兒篩查只能篩查部分Citrin蛋白缺乏癥患兒，因患兒在新生兒早期可出現(xiàn)不同程度的血氨基酸改變[13]，可能與采血時間偏早，代謝譜特征尚未呈現(xiàn)有關(guān)，有待于進一步研究。

3.3 SLC25A13基因突變分析Citrin蛋白缺乏癥是一類常染色體隱性遺傳病，定位于7q21.3，由SLC25A13基因突變所致[14]。已報道54種突變，其中與臨床表現(xiàn)密切相關(guān)的有10 個，分別為c.851_854delTATG、c.615+5G＞A、g.IVS16ins3kb、c.1638_1660dup23、c.955C＞T、c.1592G＞A、c.1399C＞T、IVS11+1G＞A、c.1092_1095delT、c.754G＞A，尤其是c.851_854delTATG、c.615+5G＞A、c.1638-1660dup23和g.IVS16ins3kb，這4個突變位點在中國人群中占所有突變的90%以上[15-19]。本研究發(fā)現(xiàn)的1例患兒為復(fù)合雜合突變，突變位點分別為c.1021+1G＞A、c.851_854delTATG，其中c.1021+1G＞A為未報到基因突變。

Citrin蛋白缺乏癥作為常見的代謝性疾病，是一種潛在的致死性疾病，早期診斷、早期治療是本病診療的關(guān)鍵。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行篩查，初步明確了該病在石家莊地區(qū)新生兒中的患病率；進一步結(jié)合基因檢測技術(shù)手段明確致病基因突變類型，為家庭再生育前的遺傳咨詢給予指導(dǎo)。