彭靜怡，劉廣超，柴立輝，喬春霞

（1.抗體藥物開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

相思子毒素（abrin）是從豆科、相思子屬植物相思子（AbrusprecatoriusL.）種子中提取的能抑制細(xì)胞蛋白合成的毒蛋白。相思子毒素與蓖麻毒素（ricin）相似，同屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosomeinactivating proteins，RIP）家族。由于來源廣、細(xì)胞毒性強(qiáng)且缺乏有效的解毒劑，相思子毒素被美國疾病控制中心定義為B類生物戰(zhàn)劑［1］。相思子毒素能通過攝入和吸入等多種方式進(jìn)入體內(nèi)，中毒后通常經(jīng)過數(shù)小時甚至數(shù)天的潛伏期才出現(xiàn)中毒綜合征。誤食相思子的種子可能導(dǎo)致胃腸道癥狀和血管滲漏，引發(fā)全身中毒乃至死亡。中毒表現(xiàn)為黏膜發(fā)紺、視網(wǎng)膜出血、食欲不振、吞咽困難、嘔吐、腹瀉、血痢、腹部痙攣性疼痛、血尿、少尿、定向障礙、驚厥和循環(huán)衰竭等癥狀，死亡原因通常為多器官衰竭，目前臨床上主要治療方式是支持性護(hù)理［2］。與蓖麻毒素相比，相思子毒素毒性更強(qiáng)，毒力是蓖麻毒素的70倍以上。相思子毒素的小鼠LD50值約為0.04 μg·kg-1，成年人攝入的致死劑量為5.0～7.0 μg·kg-1［3］。

此外，由于相思子毒素具有使核糖體RNA脫嘌呤從而抑制蛋白質(zhì)合成的能力，使其被考慮用作靶向藥物的載體。研究者試圖將相思子毒素偶聯(lián)在抗體等靶向藥物上，作為靶向癌細(xì)胞的免疫毒素運(yùn)送至腫瘤部位后發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用［4］。相思子毒素自身也具有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫的能力。早在2006年，Ramnath等［5］就發(fā)現(xiàn)相思子毒素可刺激脾和胸腺淋巴細(xì)胞的有絲分裂，即使是無毒或亞致死劑量的相思子毒素也能使正?；蚝闪鲂∈笃K細(xì)胞的活性增加，從而殺傷腫瘤細(xì)胞；且抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用出現(xiàn)時間也明顯提前。本文綜述相思子毒素結(jié)構(gòu)特征、毒作用機(jī)制、檢測及其中毒防治策略的研究進(jìn)展。

1 結(jié)構(gòu)特征和毒作用機(jī)制

1.1 結(jié)構(gòu)特征

相思子毒素是一種異二聚體蛋白質(zhì)，由具有N-糖苷酶活性的A鏈和半乳糖特異性的凝集素B鏈組成［6-7］。相思子毒素有a，b，c和d 4個亞型，相對分子質(zhì)量介于（6.3～6.7）×104之間。其中a和d亞型毒性強(qiáng)，而b和c亞型的B鏈凝集素活性低，因而僅有較低的細(xì)胞毒性［8］。相思子毒素的A鏈相對分子質(zhì)量為3.0×104，能不可逆轉(zhuǎn)地作用于哺乳動物60S核糖體大亞基的28S核糖體RNA，使其保守的α肌氨酸環(huán)的4324位核苷酸脫嘌呤，導(dǎo)致核糖體失活并抑制蛋白質(zhì)合成，從而引起細(xì)胞凋亡［9-12］。其晶體結(jié)構(gòu)顯示A鏈由3個結(jié)構(gòu)域組成，活性中心由這3個結(jié)構(gòu)域圍成的裂口構(gòu)成，其中活性位點包括Y74，V75，Y113，E164和 R167等殘基［13］。相思子毒素 B鏈?zhǔn)且环N含268個氨基酸殘基的凝集素，結(jié)合細(xì)胞表面β-D-半乳糖苷部分，由2個球形結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域都包含1個結(jié)合位點。相思子毒素的凝集素鏈與細(xì)胞表面β-D-半乳糖苷部分結(jié)合后，部分相思子毒素通過包膜內(nèi)化方式入胞，入胞的毒素少數(shù)被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)溶膠中，通過抑制蛋白質(zhì)合成促進(jìn)細(xì)胞死亡，而其他部分則被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解或循環(huán)回細(xì)胞表面［14］。

1.2 毒作用機(jī)制

在不同細(xì)胞中，相思子毒素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑并不相同。早期研究發(fā)現(xiàn)，其通過抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致活性氧生成增加和線粒體膜電位丟失從而引起線粒體應(yīng)激，啟動胱天蛋白酶3，最終導(dǎo)致DNA斷裂，且經(jīng)該毒素處理的Jurkat細(xì)胞中Fas-L、Fas-R和胱天蛋白酶8等死亡受體因子表達(dá)增加［10-11］。同時有研究表明，在不同細(xì)胞模型中，相思子毒素引起的細(xì)胞凋亡程序并不相同。如Bora等［15］研究表明，相思子毒素誘導(dǎo)的人B細(xì)胞系U266B1細(xì)胞凋亡并不依賴胱天蛋白酶途徑，而涉及溶酶體膜通透性的改變以及溶酶體中組織蛋白酶的釋放。此外，相思子毒素也可通過與抗氧化肽1（antioxidant peptide-1，AOP-1）相互作用，減弱AOP-1的抗氧化活性，從而引起線粒體應(yīng)激，并進(jìn)一步激活胱天蛋白酶3和9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。近期的研究還顯示，相思子毒素作用于Jurkat細(xì)胞后，會引起蛋白質(zhì)合成抑制（protein synthesis inhibition，PSI）介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。

為研究相思子毒素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與PSI的依從關(guān)系，Tiwari等［18］利用定點突變設(shè)計了酶活性降低約95%的相思子毒素A鏈突變體（R167L），結(jié)合蓖麻毒素B鏈形成了重組毒素。用野生型和突變型毒素分別處理KB細(xì)胞和Ovcar-3細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡動力學(xué)與毒素的PSI活性在不同細(xì)胞中具有明顯差異。在KB細(xì)胞中，兩者引起細(xì)胞凋亡的能力一致，不受突變型毒素PSI弱的影響；而在Ovcar-3細(xì)胞中，突變型毒素較野生型引起細(xì)胞凋亡的能力明顯減弱，提示該細(xì)胞中，毒素的PSI可能與凋亡作用相關(guān)。早期研究也表明，KB細(xì)胞中腦酸溶性蛋白1（brain acid soluble protein-1，BASP-1）蛋白能使大量游離的相思子毒素A鏈被隔離到細(xì)胞核中，而僅在Ovcar-3細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)游離的相思子毒素A鏈，證實了核隔離的A鏈直接介導(dǎo)的DNA損傷可能參與了KB細(xì)胞凋亡［19］。

2 檢測

從毒素快速偵檢這一角度來看，抗體的研發(fā)尤為重要，由于毒素與能通過PCR等手段特異性擴(kuò)增核酸序列的細(xì)菌和病毒類病原體不同，其通常利用基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測方法進(jìn)行診斷。2008年，Garber等［20］用兔抗相思子毒素多克隆抗體和鼠抗相思子毒素單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測法，在果汁、奶制品或調(diào)料中，相思子毒素的最低檢出限能達(dá)到0.1～0.5 μg·L-1。Zhou 等［21］通過類似的方法建立了以單克隆抗體為捕獲抗體，兔多克隆抗血清為檢測抗體的雙夾心ELISA法，在復(fù)雜環(huán)境中該方法的檢出限也可達(dá)到0.5 μg·L-1，且回收率均能達(dá)到約95%。2011年，Li等［22］用甲醛溶液處理的相思子毒素免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和篩選獲得了3株分泌特異性抗相思子毒素抗體（4G1，1G5和3C2）的雜交瘤細(xì)胞。其中，4G1是針對A鏈的抗體，1G5和3C2是針對B鏈的抗體?；?C2與4G1建立的ELISA法靈敏度高，檢測限為7.8 μg·L-1。

2017年，He等［23］也通過雜交瘤細(xì)胞的方式篩選出7株抗相思子毒素單克隆抗體Abrin 1～7，其中Abrin-1和-2與相思子毒素A鏈結(jié)合，Abrin-3，-5～-7與相思子毒素B鏈結(jié)合。選擇B鏈特異性的Abrin-3為捕獲抗體，A鏈特異性的Abrin-2為檢測抗體，建立了一種能檢測相思子毒素全毒素及其亞型混合物的雙夾心ELISA法。該法靈敏度高，特異性強(qiáng)，能在磷酸鹽緩沖鹽水和牛奶等復(fù)雜背景中檢測到相思子毒素最低濃度1 μg·L-1。同年，Tam 等［24］也報道了一組針對相思子毒素A鏈及B鏈全毒素的相思子毒素特異性單克隆抗體，以此建立了雙夾心ELISA，評估并優(yōu)化最佳配對抗體后最低檢出限為1 μg·L-1，且與其他RIP無交叉反應(yīng)。

Hansbauer等［25］報道了一種基于快速質(zhì)譜的相思子毒素檢測方法，利用偶聯(lián)有多種相思子毒素特異性抗體的磁珠，在復(fù)雜的待測樣品中分別結(jié)合相思子毒素特異性肽段，可靈敏地分辨各亞型毒素。更重要的是，可通過四極軌高分辨率儀器的平行反應(yīng)監(jiān)測模式實現(xiàn)多重、靈敏和可再生的定量分析。2018年，Isenberg等［26］開發(fā)了一種能同時定量檢測血液中蓖麻毒素和相思子毒素的診斷方法，通過同位素稀釋、固相萃取和蛋白質(zhì)沉淀處理后，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能檢測5～500 μg·L-1相思子毒素和0.3～300 μg·L-1蓖麻毒素，其質(zhì)控樣品測定的相對誤差＜10%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜19%，尤為適合蓖麻毒素和相思子毒素暴露的快速診斷。

核酸適配體是一種短的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，能高親和力、高特異性地與靶標(biāo)結(jié)合，核酸適配體易于合成、穩(wěn)定、靈敏度高等特點使其成為多種毒素檢測的新方法。Tang等［27］通過體外親和色譜法從一個非常大的核酸序列目標(biāo)庫中篩選出與相思子毒素親和力最高的單鏈DNA適配體，熒光偏振法測定其解離常數(shù)為（28±9）nmol·L-1，且該適配體的結(jié)合具有特異性；隨后該團(tuán)隊利用分子光開關(guān)試劑［Ru（phen）2（dppz）］2+，建立了一種基于核酸適配體的相思子毒素直接檢測方法，不需要標(biāo)記該核酸適配體，操作簡單，靈敏度高，可在低至1 nm的波長范圍內(nèi)直接檢測相思子毒素。該測定不僅可以在生理緩沖液中進(jìn)行，也可在更復(fù)雜的生物基質(zhì)如稀釋的血清中進(jìn)行，且具有較高的選擇性。

3 中毒防治

早在數(shù)百年前人們便知道，給小牛投喂少量的相思子種子，可以保護(hù)小牛抵御相思子毒素中毒。Ehrlich［28］采用類似的方法對小鼠進(jìn)行了免疫接種，繼而又通過皮下注射毒素進(jìn)行免疫，最終使動物產(chǎn)生高滴度抗毒素抗體。保護(hù)性抗體可通過血液從母牛傳遞給子代，在其分泌的牛奶中也能檢測到。

3.1 主動免疫

目前，針對相思子毒素的生物防護(hù)疫苗較少，主要有全分子毒素疫苗、A鏈［29］或B鏈［30］疫苗等。Griffiths等［31］報道，甲醛溶液滅活的毒素能有效保護(hù)小鼠免受天然相思子毒素的侵害。但由于此類制劑仍殘存毒性，不能進(jìn)一步推廣應(yīng)用［32］。以亞致死劑量相思子毒素或減毒后毒素免疫小鼠，也可在體內(nèi)誘導(dǎo)出保護(hù)性抗體；同時，為增進(jìn)局部呼吸道黏膜免疫，可將毒素以脂質(zhì)體微囊化方式處理，既可有效減輕肺部損傷，又可提供至少1年的全身和局部免疫，可減少抗原使用量和接種次數(shù)［3，33］。

其實，研究者們對于AB型毒素的A鏈還是B鏈更適合做疫苗尚有爭議。許多研究者認(rèn)為，B鏈較A鏈免疫原性差，不能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用［32，34-35］；但也有研究者認(rèn)為，即使B鏈無毒，產(chǎn)生的抗B鏈抗體亦能保護(hù)機(jī)體免遭毒素攻擊［36-37］。Han等［32］使用定點誘變的方式突變了相思子毒素A鏈的2個關(guān)鍵氨基酸殘基Glu164和Arg167，構(gòu)建了突變體mABRAE164A/R167L并在大腸桿菌中表達(dá)，從而獲得了毒性顯著降低但抗原性和免疫原性保持不變的毒素，并對BALB/c小鼠進(jìn)行了3次免疫，用10倍LD50劑量的天然相思子毒素攻毒。結(jié)果顯示，突變毒素能產(chǎn)生100%保護(hù)作用；此外，免疫小鼠的血清也能為未免疫小鼠提供被動保護(hù)。同年，該研究團(tuán)隊將相思子毒素A鏈突變體mABRAE164A/R167L與蓖麻毒素A鏈突變體mRICAD75A/V76M/Y80A相連，成功構(gòu)建表達(dá)并獲得了二價候選疫苗，該疫苗免疫小鼠后能抵抗6倍LD50劑量的天然相思子毒素和蓖麻毒素混合毒素的攻擊［38］。2014年，Zhang等［39］篩選出了2個可溶性表達(dá)、免疫原性良好且無毒的相思子毒素A鏈截短體（truncated abrin toxin A chain，tATA）1和tATA4，并通過鼻腔滴注（intranasal instillation）、ig和sc給藥方式分別免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)各組小鼠血清中的抗體滴度均為陽性，且tATA4誘導(dǎo)的保護(hù)效果較tATA1更好，這可能與相思子毒素A鏈的核心螺旋結(jié)構(gòu)被截斷有關(guān)。當(dāng)以SPO1作為佐劑sc給藥時，tATA4可誘導(dǎo)高滴度的抗體，完全保護(hù)小鼠抵抗40倍LD50劑量毒素的攻擊。2017年，Tiwari等［40］研究表明，對蛋白質(zhì)免疫優(yōu)勢區(qū)域的了解有助于設(shè)計出更有效的疫苗。他們基于前人的研究設(shè)計了一種相思子毒素A鏈和與相思子毒素同源的相思子凝集素重組的嵌合結(jié)構(gòu)，其中包含結(jié)合中和抗體所需的最小必須折疊域，同時對其免疫原性進(jìn)行表征。細(xì)胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，與全長相思子毒素A鏈比較，該嵌合體的毒性較某些突變體相思子毒素的毒性弱。該團(tuán)隊將嵌合體作為免疫原免疫BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)用45倍LD50劑量相思子毒素攻毒時，小鼠仍能100%存活，且被動免疫研究中也有相同的保護(hù)效果。該研究認(rèn)為結(jié)構(gòu)域特異性的嵌合體蛋白作為潛在的疫苗候選物能引發(fā)更高比率的中和抗體。

B鏈疫苗研究方面，王俊虹等［41］認(rèn)為在缺乏A鏈情況下B鏈無毒，更適合開發(fā)為疫苗。2016年，他們利用密碼子優(yōu)化軟件Condonopt對B鏈進(jìn)行基因優(yōu)化，替換大腸桿菌稀有密碼子為高頻密碼子，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE80L-ATB，并采用Ni-NTA親和色譜純化獲得了蛋白純度＞97%的重組B鏈蛋白（recombinant abrin toxin B chain，rATB）。Western印跡實驗結(jié)果表明，目的蛋白能夠特異性被抗天然相思子毒素多克隆抗體識別，細(xì)胞毒性試驗結(jié)果也表明該蛋白無毒。隨即他們通過ip給予rATB免疫小鼠，免疫后的小鼠可抵抗最高劑量為5倍LD50劑量的天然毒素，且保護(hù)率均為100%。此外組織學(xué)研究表明，用rATB免疫小鼠能降低毒素相關(guān)的組織損傷程度，提示B鏈蛋白作為候選疫苗可有效預(yù)防相思子毒素中毒。該研究也奠定了B鏈作為疫苗研發(fā)靶點的基礎(chǔ)［42］。此外，他們還構(gòu)建了一種含有蓖麻毒素B鏈和相思子毒素B鏈的雙重聯(lián)合疫苗，命名為RTB-ATB，用其免疫小鼠后可誘導(dǎo)同時中和這2種毒素的特異性抗體［43］。

3.2 被動免疫

除了疫苗，能發(fā)揮中和保護(hù)效應(yīng)的抗體也是解決毒素中毒的良好策略。為獲得能中和相思子毒素的抗體，Surendranath 等［34］通過內(nèi)酰胺-瓊脂糖親和色譜純化了相思子毒素A鏈和凝集素，構(gòu)建了重組相思子毒素A鏈（recombinant abrin A chain，rABA）蛋白并免疫小鼠。利用雜交瘤技術(shù)篩到了4株能結(jié)合天然相思子毒素和rABA的IgG單克隆類抗體。其中，D6F10結(jié)合能力最高，在天然和變性條件下均可特異性識別相思子毒素及rABA，且不與其他RIP類蛋白交叉結(jié)合。在Jurkat，MCF-7和Ovcar-3細(xì)胞模型中，D6F10均能起到保護(hù)作用且保護(hù)效應(yīng)存在濃度依賴性。此外，研究者還利用BALB/c小鼠證實了D6F10的體內(nèi)保護(hù)效應(yīng)，使之成為首個針對相思子毒素的中和性抗體。Bagaria等［44］進(jìn)一步構(gòu)建了系列相思子毒素A鏈截短體，并經(jīng)突變分析確定D6F10識別的表位是位于相思子毒素A鏈的活性位點中心附近的Thr112，Gly114和Arg118殘基，因此可以阻斷體外無細(xì)胞蛋白合成體系中相思子毒素A鏈的活性，抑制相思子毒素的PSI作用。此外，他們通過共聚焦顯微鏡觀察到與相思子毒素結(jié)合的D6F10抗體存在內(nèi)化現(xiàn)象。由于該抗體的中和活性良好，推測D6F10抗體可能干擾了相思子毒素在胞內(nèi)的輸運(yùn)，或通過物理性封閉毒素的毒性位點，從而直接阻斷其催化活性。

Kumar等［45］利用類似方法構(gòu)建了重組嵌合蛋白rABA，免疫小鼠后獲得雜交瘤細(xì)胞，并篩選出能抑制相思子毒素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的單克隆抗體A7C4。該抗體預(yù)防給藥能保護(hù)小鼠免遭毒素攻擊。與D6F10不同的是，A7C4結(jié)合相思子毒素的表位位于 A 鏈 Thr82，Gln83，His85，Asp103和 His105殘基，距離相思子毒素的活性中心較遠(yuǎn)，這與無細(xì)胞體系中A7C4不能阻斷相思子毒素A鏈抑制熒光素酶合成的結(jié)果相符。此外，研究者通過共聚焦顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，A7C4并不能抑制相思子毒素在細(xì)胞表面附著，而是與D6F10一樣隨相思子毒素A鏈入胞而被內(nèi)化。因此認(rèn)為可能存在其他胞內(nèi)中和機(jī)制抑制細(xì)胞或小鼠體內(nèi)的相思子毒素。

2018年，Mechaly等［46］用亞致死劑量相思子毒素免疫家兔后獲得高親和力的抗相思子毒素血清，以此構(gòu)建單鏈抗體噬菌體展示庫，分離出一組高親和力的抗相思子毒素特異性抗體（針對相思子毒素A鏈和B鏈的分別為6個和4個），這些抗體針對相思子毒素表面的5個不同表位，且可同時結(jié)合毒素。此外，當(dāng)用這些抗體對暴露于致死劑量相思子毒素后6 h的小鼠進(jìn)行被動免疫時發(fā)現(xiàn)，RB9，RB10，RB28和RB30這4個抗體能保護(hù)85%～95%小鼠免于死亡。

4 結(jié)語

相思子毒素作為B類生物戰(zhàn)劑，來源廣泛，易誤服，制備簡單，毒性極強(qiáng)，是我國生物防控領(lǐng)域的重要研究對象。相思子毒素能通過激活多種信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可以此為靶點設(shè)計免疫毒素靶向癌細(xì)胞，因此對其致病機(jī)制的研究很重要。在復(fù)雜環(huán)境中對相思子毒素進(jìn)行快速檢測應(yīng)用廣泛，因此如何提高檢測方法的靈敏度、避免出現(xiàn)假陰性具有重大意義。同時，國內(nèi)目前針對相思子毒素的抗體等特異性解毒劑的研發(fā)報道較少。本課題組通過對篩選出的相思子毒素鼠源單克隆抗體進(jìn)行人源化改造獲得了1株有良好中和保護(hù)作用的人源化單抗，小鼠中毒6～9 h后抗體保護(hù)率仍＞50%?？梢灶A(yù)見，包括該候選抗體在內(nèi)的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用將會增強(qiáng)我國生物安全防控力量，為相思子毒素中毒提供應(yīng)急救治策略。