王 靜，李 芳，蔣 鳴，劉紅霞，陳金娥

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005）

多發(fā)性骨髓瘤是排名第二位的成人常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤，特征是骨髓內(nèi)惡性漿細(xì)胞的克隆性增殖［1］。盡管幾種有效的治療藥物進(jìn)入臨床，如蛋白酶體抑制劑（如硼替佐米、卡菲佐米和伊沙佐米）、免疫調(diào)節(jié)藥物（如沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺）和單克隆抗體，在治療多發(fā)性骨髓瘤方面取得了巨大的進(jìn)步，但其易復(fù)發(fā)性和治療的長期性仍然困擾著患者［2］。此外，長期使用這些藥物會引起許多不良反應(yīng)，且在治療后期，患者會不同程度的產(chǎn)生耐藥性［3］。因此，迫切需要開發(fā)新的抗骨髓瘤藥物或新的治療策略，以提高或保持現(xiàn)有藥物的治療效果，并降低它們對正常細(xì)胞的毒性。

中醫(yī)藥作為惡性腫瘤的臨床輔助治療手段，可以提高機(jī)體免疫力，減輕化療副作用，提高化療藥物的療效。豬苓是一種在中國被廣泛使用的藥用真菌，是多發(fā)性骨髓瘤輔助治療的常用藥物［4］。豬苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）是豬苓的主要生物活性物質(zhì)，分子量約為1.6×105u［5］。研究顯示，PPS可增加干擾素γ刺激的巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6，-1β和-23等免疫因子，增強(qiáng)宿主免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6-7］。PPS通過使腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞極化為M1亞型抑制膀胱癌［8］。PPS與卡介苗合用不僅能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，還可以減少卡介苗的副作用。主要通過增加CD86、CD40和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同抑制效應(yīng)。PPS通過抑制卡介苗對膀胱癌細(xì)胞NF-κB信號通路的過度激活，從而減輕卡介苗對膀胱癌細(xì)胞的不良反應(yīng)［9-10］。硼替佐咪（bortezomib，BTZ）是多發(fā)性骨髓瘤的一線治療藥物。通常用于復(fù)發(fā)性或難治性骨髓瘤的治療，具有臨床療效好，副作用可控的特點(diǎn)，患者長期使用BTZ可能會出現(xiàn)耐藥性［11-12］。研究顯示，BTZ通過轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）觸發(fā)miR-135a-5p依賴性的細(xì)胞凋亡抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞［13］。BTZ可通過自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubuler-associated protein light chain 3B，LC3B）和P62調(diào)控自噬［14］。本研究通過PPS聯(lián)合BTZ處理U266細(xì)胞，檢測細(xì)胞的凋亡、自噬相關(guān)蛋白以及Akt/mTOR信號通路關(guān)健蛋白的表達(dá)水平，評估PPS聯(lián)用BTZ治療多發(fā)性骨髓瘤的潛在療效及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

PPS（南京澤朗生物科技有公司）。PPS溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過0.22 μm的濾膜過濾，以供實(shí)驗(yàn)使用。BTZ（西安楊森制藥有限公司）；RPMI-1640高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素（中國碧云天公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）；凋亡檢測試劑盒（中國凱基公司）；小鼠抗人哺乳動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）單克隆抗體（美國Proteintech公司）；凋亡試劑盒和小鼠抗人蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）和P-Akt單克隆抗體（英國Abcam公司）；小鼠抗人LC3B、P62單克隆抗體（美國CST公司）；小鼠抗人Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶3單克隆抗體（中國Abclone公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（中國聯(lián)科公司）；CO2孵育箱和酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；凝膠電泳相關(guān)器材（美國Bio-Rad公司）；GALLIOS流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 U266細(xì)胞和培養(yǎng)

人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心（上海）。U266培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗配制的完全培養(yǎng)基中，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測U266細(xì)胞存活率

以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種置于96孔板中。細(xì)胞分細(xì)胞對照組、PPS 12.5，25，50，100，200 和 400 μmol·L-1組、BTZ 10，20，30，40，60 和80 nmol·L-1組，PPS 50 μmol·L-1+BTZ 0，10，20，30，40，60和80 nmol·L-1組，細(xì)胞對照組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，置孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度（A450nm）計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白組A450nm）/（細(xì)胞對照組A450nm-空白對照組A450nm）×100%。另設(shè)PPS 12.5，25，50 μmol·L-1+BTZ 10，20，40和80 nmol·L-1不同濃度的聯(lián)合用藥組，利用Calcusyn軟件計(jì)算各組聯(lián)合用藥指數(shù)（combine index，CI），CI值=1，表示相加作用，CI＞1，表示拮抗作用，CI＜1，表示協(xié)同增效作用［15］。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測U266細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞分細(xì)胞對照組、PPS 20 μmol·L-1組、BTZ 25 nmol·L-1組和PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。4℃，300×g離心10 min，PBS洗滌，加入Annexin V和碘化丙啶室溫避光處染色15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果用FlowJo軟件（8.7.3版本）進(jìn)行分析。

1.5 Western印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白以及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取1.4分組處理的細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，并使用BCA試劑盒進(jìn)行定量。用15% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加對應(yīng)的一抗在4℃孵育過夜。Bax（1∶1000），Bcl-2（1∶1000），胱天蛋白酶3（1∶2000），活化胱天蛋白酶 3（1∶2000），LC3B（1∶4000），P62（1∶4000），Akt（1∶4000），P-Akt（1∶2000），mTOR（1∶4000）和p-mTOR（1∶2000）。37℃下與二抗（1∶10000）孵育1 h。ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，軟件分析條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA），以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白IA比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 豬苓多糖聯(lián)合硼替佐米對U266細(xì)胞存活的影響

圖1A結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組相比，PPS 12.5～400 μmol·L-1作用于U266 細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。圖1B實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BTZ 10～80 nmol·L-1作用于U266細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。圖1C實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PPS 50 μmol·L-1相比，PPS 50 μmol·L-1+BTZ 10～80 nmol·L-1作用于U266細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of polyporus polysacharide（PPS）combined with bortezomib（BTZ）on viability of U266 cells by CCK-8 assay.The cells were treated with PPS，BTZ or PPS combined with BTZ for 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS 50 μmol·L-1group.

PPS 12.5～50 μmol·L-1+BTZ 10～80 nmol·L-1聯(lián)合用藥組作用48 h后，Calcusyn軟件計(jì)算出各濃度組合的CI值均＜1，表示PPS聯(lián)合BTZ作用于U266細(xì)胞時表現(xiàn)為協(xié)同增效作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定 PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1為后續(xù)聯(lián)合用藥濃度。

2.2 豬苓多糖聯(lián)合硼替佐米對U266細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V和PI雙染色結(jié)果顯示（圖2），PPS 20 μmol·L-1和BTZ 25 nmol·L-1組較細(xì)胞對照組的凋亡率明顯升高（P＜0.01）。PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1兩藥聯(lián)用后，較單獨(dú)用藥組凋亡率明顯升高（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of PPS combined with BTZ on apoptosis rate in U266 cells by flow cytometry.U266 cells were treated with PPS 20 μmol·L-1，BTZ 25 nmol·L-1，and PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1for 48 h，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.3 豬苓多糖聯(lián)合硼替佐米對U266細(xì)胞Bax/Bcl-2和活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖3），與細(xì)胞對照組相比，PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1組 Bax/Bcl-2、活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值明顯升高（P＜0.01）。與單用PPS或BTZ組相比，PPS+BTZ組Bax/Bcl-2、活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值明顯升高（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of PPS combined with BTZ on protein expression levels of Bcl-2/Bax and cleaved-caspase 3/caspase 3 in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.4 豬苓多糖聯(lián)合硼替佐米對U266細(xì)胞P62蛋白和LC3BⅡ/Ⅰ比值的影響

細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果表明（圖4），與細(xì)胞對照組相比，PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1組P62蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），LC3BⅡ/Ⅰ比值明顯升高（P＜0.01）。與PPS 或BTZ組相比，PPS+BTZ組P62蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），LC3BⅡ/Ⅰ比值明顯升高（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of PPS combined with BTZ on protein expression level of P62 and ratio of microtubuler-associated protein light chain 3B（LC3B）Ⅱ/Ⅰ in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PPS group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.5 豬苓多糖聯(lián)合硼替佐米對U266細(xì)胞Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖5）表明，與細(xì)胞對照組相比，PPS和BTZ單用組Akt和mTOR磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），與PPS或BTZ單用組相比，PPS+BTZ組Akt和mTOR磷酸化水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of PPS combined with BTZ on phosphorylation levels of protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with BTZ group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PPS聯(lián)合BTZ能明顯抑制U266細(xì)胞的增殖，并且聯(lián)合用藥后CI均＜1，提示PPS聯(lián)合BTZ對抑制U266細(xì)胞增殖具有協(xié)同增效作用。

惡性腫瘤細(xì)胞能夠逃脫細(xì)胞凋亡，引起異常增殖和轉(zhuǎn)移。因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是腫瘤治療的有效手段。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。Bax和Bcl-2分別是促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的最主要蛋白，Bax/Bcl-2比值與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［15］。當(dāng)細(xì)胞在受到凋亡信號刺激后，線粒體膜的通透性增加，釋放出細(xì)胞色素c，啟動胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)引起凋亡［16］。本研究結(jié)果表明，PPS和BTZ聯(lián)合用藥后Bax/Bcl-2比值增加，活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值也顯著增加，說明PPS和BTZ聯(lián)合用藥能夠啟動U266細(xì)胞凋亡。

自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中是一把雙刃劍，LC3是自噬標(biāo)志性蛋白，有3種亞型：LC3A，LC3B和LC3C，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)LC3B的總量比較恒定，是檢測自噬體的常用標(biāo)記物，另一個自噬標(biāo)志性蛋白P62，是自噬的選擇性底物，最終被自噬溶酶體降解，P62表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［17］。有研究表明，BTZ可通過增加自噬水平發(fā)揮抗多發(fā)性骨髓瘤作用，還可以減少耐藥性的發(fā)生［18］。本研究結(jié)果顯示，PPS聯(lián)合BTZ用藥后P62蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3BⅡ/Ⅰ比值顯著升高，說明聯(lián)合用藥能夠誘導(dǎo)U266細(xì)胞自噬。

凋亡與自噬之間存在著交互調(diào)控，二者共享多個調(diào)節(jié)分子，例如 NF-κB，P53，PI3K，Akt和 JNK等［19］。Akt作為PI3K/Akt/mTOR 信號通路的中樞蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中被異常激活，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬等生物過程。mTOR為Akt的下游蛋白，是參與細(xì)胞自噬過程的重要負(fù)調(diào)控因子［20-21］。有研究表明，有些藥物可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路拮抗多發(fā)性骨髓瘤增殖，促進(jìn)U266細(xì)胞自噬和凋亡，耐藥組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和LC3Ⅰ表達(dá)上調(diào)。提示PI3K/Akt/mTOR信號通路不僅參與U266細(xì)胞的自噬和凋亡，還可能與U266細(xì)胞的耐藥有關(guān)［22］。本研究結(jié)果表明，PPS和BTZ聯(lián)合用藥可顯著抑制Akt和mTOR的磷酸化水平，表明PPS聯(lián)合BTZ通過抑制Akt/mTOR通路誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡與自噬，并且可能還有減少U266細(xì)胞耐藥性的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PPS聯(lián)合BTZ能抑制U266細(xì)胞增殖，并具有協(xié)同增效作用。能同時誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡和自噬，其機(jī)制可能與抑制Akt/mTOR信號通路有關(guān)，PPS與BTZ合用是否影響其他的信號通路，以及對BTZ耐藥方面的影響，還需進(jìn)一步深入研究。