施景龍 李 博 賀 歡 宋向暉

1.廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科，廣東廣州 510630；2.廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510317；3.廣東省婦幼保健院ICU，廣東廣州 510000

胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤疾病之一，其起病隱匿且病情發(fā)展較快，疾病惡性程度高，患者死亡率亦較高，是導(dǎo)致我國消化系統(tǒng)腫瘤疾病致死的主要原因之一[1]。近年來隨著腫瘤研究的展開，腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等多項過程中相關(guān)基因在腫瘤病情評估和預(yù)后預(yù)測的研究成為熱點。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等為EMT 相關(guān)蛋白，亦可參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展[2]。通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）可促進EMT 從而促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3-4]。TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白均可能與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，但目前關(guān)于胰腺癌組織中TGF-β1、EMT 相關(guān)蛋白表達水平及其與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究仍較少。因此，本研究檢測胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白的表達水平，并分析其與病情以及腫瘤侵襲的關(guān)系，旨在為胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移防治提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月～2020年2月廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科（32例）和廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科（28例）收治的60例胰腺癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為胰腺癌，首次確診；②預(yù)計存活期在3個月以上；③行胰腺癌根治手術(shù)；④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前經(jīng)抗癌治療或合并手術(shù)禁忌證；②合并腫瘤轉(zhuǎn)移或其他腫瘤疾病患者；③合并肝腎功能障礙患者；④合并心腦血疾病患者；⑤妊娠期或哺乳期女性；⑥精神狀態(tài)異常患者。60例胰腺癌患者中，男35例，女25例；年齡45～76歲，平均（60.52±13.73）歲；高分化癌28例，低分化癌32例；腫瘤部位位于胰頭33例，胰體20例，胰尾7例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；腫瘤直徑＜2 cm 7例，2～4 cm 28例，＞4 cm 25例。所有患者及其家屬均知情同意，且本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

即用型SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒、鼠抗人Vimentin 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鼠抗人TGF-β1 單克隆抗體均購自南京凱基公司，工作濃度1∶100，SW-CY-1F型凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠，微量移液器均購自德國Eppendorf 公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司，低溫冰箱購自山東青島海爾公司，Model550 酶標(biāo)儀購自美國BIORAD公司，糖類抗原（CA）199和CA242 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測 以手術(shù)獲取的胰腺癌組織和癌旁組織為待檢測標(biāo)本，免疫組織化學(xué)染色法檢測胰腺癌組織和癌旁組織的TGF-β1 以及E-cadherin、Vimentin 等EMT 相關(guān)蛋白陽性表達率。待檢測樣本經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋切制成厚度為4 μm連續(xù)切片，二甲苯浸泡10 min 脫蠟，梯度酒精脫水去除二甲苯，3%過氧化氫溶液進行內(nèi)源性過氧化物酶的滅活，檸檬酸工作液加熱行抗原熱修復(fù)，添加40 μL 相應(yīng)一抗，室溫（20℃）下孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3 遍，添加40 μL 相應(yīng)二抗，室溫下孵育0.5 h，PBS 洗滌3 遍，DAB 顯色2 min后顯微鏡下觀察，顯色滿意后以清水終止反應(yīng)，行蘇木精復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，吹干并以中性樹脂封片。隨機選取3個視野（400×）進行觀察，TGF-β1、Vimentin 表達定位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin 表達定位于細(xì)胞膜，以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性，以陽性細(xì)胞＜10%為陰性，陽性細(xì)胞≥10%為陽性，統(tǒng)計陽性表達率。

1.3.2 酶聯(lián)免疫檢測 入組次日患者均取空腹肘靜脈血3 mL檢測血清CA199和CA242水平，血液樣本采集采用一次性針管和不含熱原和內(nèi)毒素試管，1500 r/min、3 cm 半徑、4℃環(huán)境中離心10 min，待分層后收集上層血清在-20℃低溫冰箱冷藏待測。CA199和CA242 ELISA 試劑盒固相包被板在室溫（20℃）下平衡約20 min，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 分別加入標(biāo)準(zhǔn)品孔，取待測樣本10 μL 和樣本稀釋液40 μL 先后加入樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100 μL 并在37℃水浴恒溫箱孵育1 h，棄去反應(yīng)液并吸水紙上拍干，洗滌，每孔中均加入顯色劑A、B 各50 μL，輕輕搖晃混勻后在37℃恒溫箱中避光孵育15 min，每孔中均加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)在450 nm 波長處測量各孔的吸光度（OD）值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本吸光度計算樣本濃度。

1.3.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期狀況檢測 采用PhilipsIE33型超聲儀、3.5～6 MHz 探頭頻率常規(guī)行超聲檢查，觀察胰腺腫瘤形態(tài)、回聲、陰影狀況以及邊界模糊情況，行常規(guī)淋巴結(jié)掃描，對可疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位取樣行病理檢查，確定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期狀況，采用美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第8版TNM 分期[5]中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；Kendall 相關(guān)法分析胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期的關(guān)系，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平的比較

以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性，TGF-β1、Vimentin 表達于細(xì)胞質(zhì)而E-cadherin 表達于細(xì)胞膜。胰腺癌組織細(xì)胞中TGF-β1 和Vimentin陽性表達細(xì)胞數(shù)占多數(shù)，僅有少數(shù)胰腺癌組織細(xì)胞為E-cadherin陽性表達；而在癌旁組織細(xì)胞中僅有少量細(xì)胞為TGF-β1 或Vimentin陽性表達，而E-cadherin陽性表達細(xì)胞數(shù)占多數(shù)（圖1～2，封三）。與癌旁組織比較，胰腺癌組織中TGF-β1 和Vimentin陽性表達率升高而E-cadherin 的陽性表達率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在胰腺癌組織中的表達（免疫組織化學(xué)染色法，400×）

圖2 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在癌旁組織中的表達（免疫組織化學(xué)染色法，400×）

表1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平的比較[n=60，n（%）]

2.2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的比較

TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；E-cadherin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3～T4期比例均低于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的比較

2.3 胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的關(guān)系分析

Kendall 相關(guān)分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織TGF-β1和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均呈正相關(guān)（TGF-β1：r=0.786、0.835、0.882、0.874，P＜0.05；Vimentin：r=0.757、0.792、0.808、0.849，P＜0.05），而胰腺癌組織E-cadherin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.842、-0.889、-0.818、-0.793，P＜0.05）。

3 討論

胰腺癌是臨床常見惡性腫瘤，好發(fā)于男性人群，發(fā)病率近年來呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，其早期癥狀隱匿均無明顯的特異性，早期確診困難，且病情發(fā)展迅速，死亡率較高[6-8]。侵襲轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者病情惡化和患者死亡的重要原因[9-12]。本研究中，近一半的確診胰腺癌患者出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而浸潤分期為T3～T4期，而血清CA199和CA242水平明顯較高，其侵襲轉(zhuǎn)移明顯，需對其侵襲轉(zhuǎn)移進行有效預(yù)防和控制以緩解病情，改善療效和預(yù)后。近年來，腫瘤研究開展較多，腫瘤相關(guān)基因和蛋白表達檢測在腫瘤病情和預(yù)后評估中應(yīng)用成為熱門。

TGF-β1 參與腫瘤的細(xì)胞增殖、分化調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、促進細(xì)胞外基質(zhì)形成以及免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等多個過程，在腫瘤疾病早期具有腫瘤抑制因子的作用，而隨著腫瘤發(fā)展，TGF-β1 對腫瘤細(xì)胞的抑制作用失效，反而可刺激腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制免疫并促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13-16]。本研究中，胰腺癌組織中TGF-β1 陽性表達率高于其癌旁組織（P＜0.05），證實TGF-β1 在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有促進作用；TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3～T4期比例均高于其陰性表達患者（P＜0.05）；相關(guān)分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織TGF-β1 表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期均密切相關(guān)，可能促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，TGF-β1 在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評估。EMT 在胰腺癌等腫瘤疾病演進中扮演重要角色，EMT 具有上皮細(xì)胞極性喪失和間質(zhì)特征，可下調(diào)E-cadherin 等上皮細(xì)胞性標(biāo)志物并上調(diào)Vimentin 等間質(zhì)性標(biāo)志物，從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[17-19]。本研究中，胰腺癌組織中E-cadherin陽性表達率降低而Vimentin陽性表達率升高，提示EMT 在胰腺癌發(fā)展中可能具有促進作用，這與Krebs 等[20]研究的Zeb1 激活EMT 促進胰腺癌的轉(zhuǎn)移結(jié)論以及Sheng 等[21]研究的促進EGF 誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞EMT 可促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展結(jié)論一致。E-cadherin、Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3～T4期比例與其陰性表達患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Kendall 相關(guān)分析提示，胰腺癌腺癌組織E-cadherin和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均密切相關(guān)，EMT 可能促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，E-cadherin、Vimentin 等EMT相關(guān)蛋白在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評估。而對TGF-β1 以及EMT干預(yù)可能為胰腺癌防治的有效措施。

綜上所述，胰腺癌組織TGF-β1、Vimentin、E-cadherin 表達均與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能用于胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移評估。