侯玉鳳,寧 揚(yáng)，陳曉雯，韓澤朝，蔡巧利，陳甜甜，謝全喜，徐海燕

(山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000)

當(dāng)今世界，各類疫病肆虐，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。抗生素對各類疫病的治療發(fā)揮了積極作用，但是抗生素的大量使用加劇了畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的積累，使其對病原微生物的抗藥性增加，不僅如此，抗生素的大量使用使得畜禽產(chǎn)品中藥物殘留增加，嚴(yán)重威脅人類健康。面對抗生素濫用的危害，抗生素替代產(chǎn)品的研究與應(yīng)用引起了廣大研究者的重視，尋找抗生素替代產(chǎn)品也成為行業(yè)發(fā)展的必然需求。益生菌是當(dāng)足量補(bǔ)充時(shí)對宿主健康有益的、活的微生物。益生菌能夠產(chǎn)生有助于動物消化吸收的酶來促進(jìn)動物機(jī)體生長和保護(hù)動物機(jī)體健康，可作為飼料替抗添加物，在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。使用益生菌可增強(qiáng)動物的免疫力，減少使用抗生素，可達(dá)到健康養(yǎng)殖、生產(chǎn)健康食品的目標(biāo)。在當(dāng)前提倡減抗養(yǎng)殖的形勢下，益生菌作為一種新型、綠色、無耐藥性的產(chǎn)品，在世界畜禽養(yǎng)殖業(yè)禁抗大潮中越來越受到重視。

結(jié)合諸多研究者的研究進(jìn)展對益生菌的作用機(jī)制及在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行了闡述，以期為益生菌的推廣應(yīng)用提供參考資料。

1 益生菌的作用機(jī)制

研究表明，益生菌不僅在促進(jìn)腸道蠕動、維持腸道穩(wěn)態(tài)，抑制有害病原體，維持宿主腸道菌群的生態(tài)平衡中發(fā)揮作用，也能改善免疫反應(yīng)，對抗各種病原體(細(xì)菌和病毒)感染[1-5]。

益生菌的抗菌、抗病毒活性主要與以下三種因素相關(guān)。一是與有害微生物爭奪營養(yǎng)物質(zhì)；二是分泌產(chǎn)生多種抗菌代謝物，如有機(jī)酸、細(xì)菌素、細(xì)菌素樣底物(BLS)、去結(jié)合膽汁酸、醇和H2O2等，這些化合物的作用通常通過多種不同的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，包括酸化、抑制DNA回旋酶或RNA聚合酶活性、在細(xì)胞質(zhì)膜上形成孔隙、氧化和改變脂質(zhì)Ⅱ的活性；三是益生菌產(chǎn)生的代謝物之間的相互作用，具有生長抑制潛力的益生菌代謝產(chǎn)物被認(rèn)為有重要的研究價(jià)值[6]。

1.1 益生菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì) 益生菌通過多種機(jī)制對宿主產(chǎn)生作用，包括產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸和細(xì)菌素，具有強(qiáng)大的抗菌活性。益生菌通過在敏感微生物的細(xì)胞膜上形成孔隙，從而發(fā)揮抗菌作用。益生菌能夠在胃腸道定值，刺激分泌細(xì)菌素，保護(hù)宿主不受感染。細(xì)菌素可以保護(hù)機(jī)體抵抗多種致病菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌和沙門氏菌等。潘氏細(xì)胞通過釋放抗菌肽以應(yīng)對腸道病原菌的刺激，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的先天免疫應(yīng)答。益生菌能夠分泌有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，阻止病原菌的粘附和定值[7]。益生菌產(chǎn)生的代謝物起到殺滅、定植和信號肽的作用，因此，它們能夠抑制病原體的侵襲，調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，并改變胃腸道微生物群的組成[6,8,9]。益生菌含有多個(gè)基因位點(diǎn)，編碼抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生是其在一個(gè)異質(zhì)微生物群落中持續(xù)生存的基本生存特征。它們可以起到以下作用：(a)定植輔助物-促進(jìn)生產(chǎn)菌株進(jìn)入已被其他微生物占據(jù)的現(xiàn)有生態(tài)位；(b)殺死肽-抑制競爭對手的增殖；(c) 信號肽-通過群體感應(yīng)和異質(zhì)群體中的細(xì)菌串?dāng)_或通過向宿主免疫系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)送信號來影響其他細(xì)菌[10]。細(xì)菌素可以作為免疫系統(tǒng)的傳感器，表明新的細(xì)菌攻擊正在發(fā)生[11]。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬擁有強(qiáng)大的抗菌藥物庫，枯草芽孢桿菌NCIB 3610可產(chǎn)生一種具有抑制兩種魚類病原體活性的抗菌化合物混合物，對新藥物的研發(fā)有重要的參考價(jià)值[12]。

1.2 益生菌的粘附特性 細(xì)胞表面疏水性和自聚集性在細(xì)菌粘附腸上皮細(xì)胞中具有競爭優(yōu)勢，并防止益生菌在蠕動過程中從人體腸道排出。益生菌具有粘附和共聚能力，益生菌通過黏附素結(jié)合到宿主細(xì)胞的受體上，與致病菌競爭與宿主的結(jié)合位點(diǎn)，通過占位保護(hù)性作用來抑制致病菌的生長和繁殖[13]。鼠李糖乳桿菌的SpaCBA-pili在粘附、宿主信號傳導(dǎo)、生物膜形成和糞腸球菌等病原體的競爭性排斥等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。SpaC在鼠李糖酵母菌強(qiáng)黏附表型中起關(guān)鍵作用[14]。益生菌的表面粘附特性，如疏水性和聚集性是益生菌篩選要素中的重要性能。革蘭氏陽性桿菌胞外基質(zhì)蛋白作為內(nèi)皮細(xì)胞定殖的橋梁，在胃腸道與宿主細(xì)胞的粘附接觸中起著重要作用。細(xì)菌與胃腸道的粘附是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及一些非特異性和特異性的細(xì)胞外和細(xì)胞表面配體受體。

1.3 益生菌能夠產(chǎn)生免疫球蛋白A 免疫球蛋白A (IgA)是體液免疫反應(yīng)的一部分，具備基本的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和必要的粘膜屏障功能[15-16]。IgA可與共生菌、病原菌和毒素結(jié)合，優(yōu)化樹突狀細(xì)胞作用和整體免疫反應(yīng)。研究表明益生菌可以誘導(dǎo)分泌產(chǎn)生IgA，協(xié)同維持免疫監(jiān)視。粘膜表面由高度多樣的共生微生物群定殖。分泌型IgA(SIgA)可促進(jìn)共生菌的存活，同時(shí)對病原菌的入侵起抑制作用。細(xì)菌包衣可以通過抗原特異性SIgA識別、多反應(yīng)性和SIgA相關(guān)聚糖介導(dǎo)。研究表明從SIgA中去除N-聚糖會降低SIgA介導(dǎo)的保護(hù)作用。粘膜的表面，尤指腸道，被大量高度多樣性的微生物群定植。在不損害粘膜組織完整性的前提下的生理區(qū)室的微生物群參與了先天免疫和特異性免疫的互補(bǔ)機(jī)制的復(fù)雜相互作用。體內(nèi)細(xì)菌被粘膜抗體包裹，在人類中主要是同種型的SIgA，在對抗致病微生物的同時(shí)也能夠促進(jìn)內(nèi)源性共生粘膜微生物群的成功存活和遏制。然而，尚不清楚這種細(xì)菌涂層是否完全依賴于高度特異性抗體活性，多反應(yīng)性，以及IgA相關(guān)聚糖與微生物互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的相互作用[17]。

1.4 益生菌代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物 益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可與細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，間接調(diào)節(jié)免疫功能，這些化合物可以通過抑制組蛋白去乙?；竵碚{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)B細(xì)胞分化和抗體合成，改善抗原-抗體反應(yīng)[18-19]。微生物群代謝產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物是與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的必需氨基酸，如色氨酸[20]。色氨酸代謝產(chǎn)物通過減弱TNF-α激活NF-κB和減少促炎趨化因子的表達(dá)，除加強(qiáng)腸上皮屏障緊密連接外，腸道菌群還可以通過合成復(fù)合B族維生素，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[21]，如枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生必需的營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、維生素等)促進(jìn)動物生長[22]。

除此之外，特異性益生菌調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)，協(xié)同保護(hù)腸上皮細(xì)胞上皮的完整性。益生菌處理后的上皮細(xì)胞中ZO-1和其他緊密連接蛋白的表達(dá)水平高于單獨(dú)感染病原菌的上皮細(xì)胞。益生菌菌株(乳酸菌、雙歧桿菌和鏈球菌)也被證明可以調(diào)節(jié)黏液蛋白的表達(dá)，改善黏液層的特性，并間接支持腸道免疫系統(tǒng)，黏液層形成了保護(hù)膜避免了致病微生物的粘附。益生菌還可以調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的基因表達(dá)。益生菌已被證明通過維持和恢復(fù)上皮功能，維持粘膜免疫穩(wěn)態(tài)和抑制致病菌來促進(jìn)腸道健康[23]。

1.5 益生菌衍生可溶性因子 益生菌衍生因子是益生菌的功能成分。功能性益生菌衍生因子包括益生菌產(chǎn)品(蛋白質(zhì)分子、碳水化合物和細(xì)胞壁成分)和代謝物(由益生菌制成)的鑒定，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一條解釋益生菌與宿主相互作用的新途徑。這些因子已被證明可以調(diào)節(jié)宿主的反應(yīng)，并被認(rèn)為是治療的靶點(diǎn)。益生菌的功能也可能與宿主遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。宿主遺傳學(xué)和環(huán)境影響腸道微生物群的組成和功能。作為腸道微生物群的組成部分，益生菌衍生因子與宿主之間的相互作用已經(jīng)成為研究益生菌介導(dǎo)宿主免疫機(jī)制的熱點(diǎn)[24]。

2 益生菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

當(dāng)今世界，各種細(xì)菌病和病毒病對各國畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對于細(xì)菌病，由于抗生素的濫用，使得細(xì)菌耐藥性增加，同時(shí)肉產(chǎn)品中藥物的殘留，也給人類的健康構(gòu)成一定的威脅。針對于各種病毒病，疫苗預(yù)防仍然是主要的方法。但是傳統(tǒng)疫苗只能針對單一血清型的病毒產(chǎn)生抗體，具有局限性。越來越多的研究表明使用益生菌在預(yù)防畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的細(xì)菌病和病毒病發(fā)揮了重要作用。

2.1 大腸桿菌 在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，大腸桿菌是危害養(yǎng)殖動物的主要疾病之一，每年因?yàn)榇竽c桿菌相關(guān)疾病的發(fā)生給養(yǎng)殖業(yè)直接或間接地造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[25]。大腸桿菌廣泛存在于自然界，能使雞的免疫功能受到抑制，可在體內(nèi)大量繁殖，引起腹膜炎、輸卵管炎和肺炎等疾病。良好的飼養(yǎng)管理是保證該病低發(fā)病率的關(guān)鍵。益生菌作為飼料添加劑預(yù)防雞大腸桿菌病的發(fā)生具有顯著的功效。先前的研究表明，日糧中添加植物乳桿菌可改善腸道健康，降低因大腸桿菌攻擊造成的死亡率[26]。有研究表明唾液乳桿菌通過減少大腸桿菌O78的定植而顯示出對大腸桿菌O78攻擊的保護(hù)作用[27]。Yoda的研究表明經(jīng)口給予格氏乳桿菌TMC0356(TMC0356)可使小鼠大腸桿菌病早期癥狀消失加快，死亡率明顯降低。與對照組相比，經(jīng)口給予TMC0356的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性和白IL-6產(chǎn)生顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果提示部分乳酸菌可通過增強(qiáng)宿主的天然免疫功能，保護(hù)宿主免受EPEC感染，減輕感染引起的癥狀[28]。Guo的研究表明在大腸桿菌攻擊后檢測心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中的大腸桿菌含量發(fā)現(xiàn)，飼喂枯草芽孢桿菌組的雞的大腸桿菌含量明顯低于對照組。此外，枯草芽孢桿菌可觸發(fā)Toll樣受體4(TLR4)，誘導(dǎo)雞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和IL-8)以產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答[29]。

2.2 雞新城疫病毒 新城疫是一種病毒性疾病，在大多數(shù)鳥類中引起呼吸困難、眶周水腫和共濟(jì)失調(diào)。由于新城疫病毒(NDV)的低反應(yīng)性和多劑量需求，現(xiàn)有的疫苗受到限制。Bautista-Garfias的研究表明雛雞服用干酪乳桿菌后接種新城疫病毒，與空白對照組相比，死亡率可由22.22%降低至5.55%，同時(shí)對雞的體重也顯著增加[30]?？莶菅挎邨U菌BYS2被證明能降低感染組織和器官中的新城疫病毒(NDV)載量，顯著增加感染雞的存活率(P<0.05)。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)BYS2能提高肉雞血清中IgG水平和IgM水平，主要模式識別受體(PRRs)、抗病毒蛋白、促炎細(xì)胞因子和抗病毒防御素的表達(dá)也明顯顯著高于對照組(P<0.05)。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肉雞的法氏囊免疫器官指標(biāo)明顯高于對照組(P<0.05)[29]。

2.3 禽流感病毒 禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)屬甲型流感病毒，能引起鳥類和哺乳動物呼吸道癥狀的傳染性疾病[31]。全世界家禽中都有禽流感病毒的報(bào)道，禽流感病毒對人類健康的影響是巨大的。因血清型眾多，禽流感疫苗很難針對所有的血清型都產(chǎn)生作用。從韓國泡菜中分離得到的腸系膜明串珠菌YML003具有抗H9N2亞型禽流感病毒活性、免疫調(diào)節(jié)作用、胃液和膽汁耐受性以及對抗生素的耐藥性，是家禽應(yīng)用的理想益生菌候選菌株[32]。L QY等[33]構(gòu)建并表達(dá)了流感抗原NP和M2與鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC的融合蛋白，對雛雞進(jìn)行口服免疫，檢測血清抗體、黏膜抗體和特異性細(xì)胞免疫發(fā)現(xiàn)分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和IgG的表達(dá)水平均增加，可誘導(dǎo)雞脾臟產(chǎn)生強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)重組NC8-pSIP409-pgsA'-NP-M2-FliC介導(dǎo)的有效保護(hù)雞流感病毒，并降低病毒在肺部的滴度。該研究證實(shí)了植物乳桿菌表達(dá)流感病毒NP-M2和黏膜佐劑(FliC)可以為動物產(chǎn)生一種黏膜疫苗候選物，以抵御禽流感病毒的感染。該研究為開發(fā)新型高效的植物乳桿菌(L.plantarum)口服疫苗以控制禽流感病毒在家禽業(yè)的傳播奠定了基礎(chǔ)。

2.4 傳染性法氏囊病毒 傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)感染會給家禽生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，接種疫苗是預(yù)防該病的重要途徑之一。然而，由于IBDV對機(jī)體的免疫抑制，疫苗接種的效果往往不盡人意。氧化應(yīng)激是家禽免疫抑制的常見原因[34-35]。因此，近年來，降低氧化應(yīng)激影響的營養(yǎng)性飼料添加劑越來越受到重視。乳酸菌作為第一個(gè)被官方認(rèn)可的微生物飼料添加劑，由于其生產(chǎn)成本低、利用率高而具有無可比擬的優(yōu)勢。Jian Wang的研究證實(shí)，唾液乳桿菌可增強(qiáng)IBDV疫苗接種后的免疫應(yīng)答[26]。

2.5 輪狀病毒 輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬呼腸孤病毒科，常引起多種幼齡動物急性腹瀉，對畜牧業(yè)發(fā)展有較大危害。輪狀病毒分多種型，因而使得輪狀病毒病的防控存在難度[36]。乳酸桿菌是主要的革蘭氏陽性益生菌之一，在人和豬的腸道中也有共棲體。鼠李糖乳桿菌GG株(LGG)對輪狀病毒病的作用已在大量臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，包括縮短輪狀病毒腹瀉的持續(xù)時(shí)間，減少腹瀉發(fā)作次數(shù)，減少輪狀病毒的脫落，使腸道通透性正?；?，增加輪狀病毒特異性抗體的產(chǎn)生[37-38]。將豬輪狀病毒(PRV)OSU株與嗜酸乳桿菌(LA)或鼠李糖乳桿菌GG(LGG)共同接種IPEC-J2細(xì)胞。在輪狀病毒感染前后應(yīng)用LA或LGG治療。研究結(jié)果表明LA和LGG處理的細(xì)胞并沒有減少病毒的復(fù)制。PRV感染刺激了粘蛋白3分泌的增加，而LGG治療輪狀病毒感染的細(xì)胞減少了PRV誘導(dǎo)的粘蛋白分泌反應(yīng)。LGG單獨(dú)處理可增加膜結(jié)合型粘蛋白3的產(chǎn)生，但不增加粘蛋白的分泌，提示LGG通過維持和增加MUC3粘蛋白的膜結(jié)合形式對上皮細(xì)胞起保護(hù)作用，其作用是減少輪狀病毒顆粒對上皮細(xì)胞的粘附。

除此之外，益生菌還可作為一種環(huán)境改良益生菌在凈化養(yǎng)殖舍內(nèi)空氣、糞便發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥、廢水發(fā)酵處理中同樣發(fā)揮重要作用，對養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)生態(tài)循環(huán)發(fā)展有重要的參考價(jià)值[39]。

3 小結(jié)與展望

抗生素的廣泛使用使得畜禽的耐藥性增加，耐藥范圍正在擴(kuò)大，不僅無法治療畜禽疾病，且細(xì)菌抗性基因會通過多種途徑傳播到外界環(huán)境中，造成環(huán)境污染，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全[40]。新的抗病毒藥物的開發(fā)就顯得尤為迫切。

目前隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力、治療人畜疾病以及促進(jìn)人類健康和畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。目前，選擇正常菌群的乳酸菌為載體，構(gòu)建重組乳酸菌已在預(yù)防細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原感染宿主方面迅速開展起來，將它們用于預(yù)防相應(yīng)疫病模型中均已取得了較好的防治效果[41]。但是研究表明益生菌在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中還存在著菌種存活率低、難以在腸道定值的問題，這就需要未來研究者在菌種篩選、加工、貯存和臨床評價(jià)等方面進(jìn)一步研究來提高益生菌的益生效能[42]。

研究表明，益生菌功能受環(huán)境溫度、益生菌菌種、管理水平和動物種類等因素的影響。益生菌作為腸道微生物群的組成部分，其功能也可能與宿主遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。目前，益生菌與宿主之間的相互作用正在成為研究益生菌介導(dǎo)宿主機(jī)體的靶點(diǎn)。使用益生菌作為載體直接向腸道輸送抗感染和腸道上皮修復(fù)因子可能是未來益生菌應(yīng)用的一個(gè)顯著進(jìn)步。目前的證據(jù)突出了益生菌和益生菌衍生因子在支持宿主體內(nèi)平衡方面的潛力，在畜禽養(yǎng)殖和畜禽疾病的預(yù)防治療方面具有較強(qiáng)潛力[24]。相信隨著對益生菌作用機(jī)理的進(jìn)一步研究，益生菌將會給畜禽業(yè)帶來更多的福利。