魏秀麗，馮言言，張傳津*，張 琦，楊志昆，馮 濤

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室，動物源細菌耐藥性監(jiān)測與精準化用藥山東省工程實驗室，濟南250100；2.齊魯動物保健品有限公司，濟南250100)

加米霉素為動物專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其制劑加米霉素注射液主要治療對加米霉素敏感的溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌引起的牛呼吸道疾病，治療對加米霉素敏感的胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病[1-2]。加米霉素抗菌譜廣[3]，抗菌活性強，藥代動力學特征優(yōu)良[4-5]，臨床療效好[6-8]，毒副作用小[9-10]，與同類產(chǎn)品替米考星相比，安全性高，無耐藥性，對豬牛呼吸系統(tǒng)疾病的防治起到了關(guān)鍵作用，保障了食品安全[11-12]。在中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第16號等文獻中對加米霉素及其注射液均采用普通高效液相色譜方法[13-17]檢測，但檢測時間比較長，所用流動相量比較大，本實驗進行了原料藥中加米霉素含量測定的超高效液相色譜-二極管陣列檢測法(UPLC-PDA)研究。超高效液相色譜法大大縮短了檢測用時。另流動相用量極大減少，減少試驗耗材的用量，可極大減少對環(huán)境的污染，并降低廢液處理的成本。本試驗建立的超高效液相色譜法具備精準快捷、經(jīng)濟環(huán)保的特點，能有效控制加米霉素原料的質(zhì)量，可作為企業(yè)及相關(guān)檢驗機構(gòu)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 加米霉素對照品，含量98.5%，齊魯動物保健品有限公司提供；乙腈為色譜純；氨水為分析純；超純水。加米霉素原料，來自齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，美國waters 公司；配Waters 2695高效液相色譜儀，美國waters 公司，配二極管陣列檢測器。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 取本品精密稱定16 mg，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。

1.3.2 標準儲備液的制備 精密稱取加米霉素對照品16 mg(折含量后)，加乙腈：水(70∶30)溶解，并定容至10 mL，配制成1600 μg/mL儲備液。

1.3.3 標準工作液的制備 取儲備液適量，配制成標準工作液：每1 mL含加米霉素1200、800、400、200、80、40、20 μg/mL的溶液。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；以乙腈為流動相A，氨水(0.1∶30)為流動相B，以70∶30的比例進行等度洗脫；二極管陣列檢測器，掃描范圍190～400 nm，檢測波長為208 nm，柱溫35 ℃，進樣室溫度10 ℃，流速為0.45 mL/min，進樣量1 μL。

1.3.5 重復性試驗 精密吸取加米霉素對照品儲備液，制成每1 mL含加米霉素400 μg的對照品溶液，重復配制6份，進樣，計算其峰面積RSD。精密吸取上述對照品溶液，重復進樣6次，計算其峰面積RSD。

1.3.6 準確度試驗 取本品精密稱定14.4 mg至20 mL容量瓶，加1600 μg/mL標準儲備液1 mL，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。平行做六份上機測定，按外標法以峰面積計算加米霉素的回收率和RSD。

1.3.7 檢測限和定量限的測定 對加米霉素的標準工作液，進行UPLC的分析，并逐級降低其濃度，以溶液檢測時的信噪比S/N≥3作為檢測限、S/N≥10作為定量限。

1.3.8 不同色譜條件樣品檢測比較 分別使用高效液相色譜儀(參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第16號文[1], 流速：1.2 mL/min；進樣量：10 μL，紫外檢測器)和超高效液相色譜儀(流速：0.45 mL/min；進樣量：1 μL，二極管陣列檢測器)在不同的色譜條件下運行，對同一樣品中加米霉素的含量和出峰時間分別進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得加米霉素色譜峰峰形良好，且均達到基線分離，在1.3.4項條件下，加米霉素對照品和加米霉素原料樣品，色譜保留時間約為4.2 min，分離度均滿足要求。

2.2 線性 在選定的色譜條件下，使用等度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，加米霉素在80～1600 μg/ mL的范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=272.2x+193.23，R2=0.9996。其標準曲線見圖1。

圖1 加米霉素標準曲線Fig 1 Standard curve of gamithromycin

2.3 重復性試驗 在選定的色譜條件下，配制400 μg/mL加米霉素對照品溶液，重復配制6份，進樣，測得加米霉素峰面積RSD為0.43%；取400 μg/mL加米霉素對照品溶液，重復進樣6次，測得加米霉素峰面積RSD為0.26%，均滿足實驗要求。

2.4 準確度實驗 加米霉素的平均回收率為99.80%，RSD分別為0.32%(表1)。

2.5 檢測限和定量限 40 μg/mL加米霉素對照品溶液信噪比≥3為檢出限，80 μg/mL加米霉素對照品溶液信噪比≥10為定量限(圖2、圖3)。

表1 加米霉素添加回收實驗結(jié)果(n=6)Tab 1 Experimental results of gamithromycin fortified recovery (n=6)

圖2 40 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC 1 μLFig 2 40 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

圖3 80 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC 1 μLFig.3 80 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

2.6 不同色譜條件樣品檢測結(jié)果的比較 不同色譜條件下的主成分理論塔板數(shù)、保留時間等參數(shù)的比較見表2。

表2 不同色譜條件下的主成分不同色譜參數(shù)的比較Tab 2 Comparison of principal components with different chromatographic parameters under different chromatographic conditions

由表2可見，使用waters 的CSH C18色譜柱理論塔板數(shù)非常高，性能是完全滿足要求的。光譜圖見圖4～圖5；色譜圖見圖6～圖9。保留時間約為4.2 min，滿足檢測需求。

圖4 加米霉素對照品UPLC光譜圖Fig 4 UPLC spectrogram of gamithromycin control

圖5 加米霉素對照品HPLC光譜圖Fig. 5 HPLC spectrogram of gamithromycin control

圖6 800 μg/mL加米霉素對照品UPLC色譜圖(1 μL)Fig 6 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (1 μL)

圖7 800 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC (1 μL)Fig.7 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin drug substance (1 μL)

圖8 800 μg/mL加米霉素對照品HPLC 色譜圖(10 μL)Fig 8 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (10 μL)

使用waters超高效液相色譜儀(色譜條件見1.3.4項)和高效液相色譜儀(色譜條件見1.3.7項)，對同一樣品中加米霉素的含量(按無水物計算)分別進行了比較(表3)，無顯著差異，相對偏差均小于1%，表明本實驗方法簡單可行，結(jié)果精確可靠。

圖9 800 μg/mL加米霉素原料HPLC色譜圖(10 μL)Fig.9 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin raw material (10 μL)

表3 不同色譜條件下加米霉素含量檢測結(jié)果表(n=4)Tab 3 Results of different chromatographic conditions for the content of gamithromycin (n=4)

由于兩種色譜方法均已通過其方法學驗證，均可以準確控制其指標成分。從檢測效率上看，優(yōu)選超高效法(UPLC)。

3 討論與結(jié)論

3.1 UPLC方法波長的選擇及定性鑒別 本研究將加米霉素的對照溶液利用PDA檢測器采集其光譜圖，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，加米霉素在198.2 nm左右有最大吸收，根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分，可以作為定性鑒別的手段；198.2 nm信號噪音較大，最終選擇同原農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告中208 nm作為檢測波長，35 ℃柱溫，保留時間約為4.2 min。

3.2 UPLC方法色譜柱耐用性實驗 改變流速0.44、0.46 mL/min，柱溫35 ℃不變，保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi)。改變柱溫33、37、40 ℃，流速0.45 mL/min不變，保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi)，均能達到良好的分離度和精確的含量測定結(jié)果。色譜柱性能穩(wěn)定，適合本項目加米霉素含量的測定。

3.3 本方法與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的質(zhì)量標準[13]的結(jié)果對比 本實驗選擇了獸藥企業(yè)的加米霉素原料進行含量測定，分別采用高效液相色譜方法和超高效液相色譜方法，原料中加米霉素含量相對偏差均小于1%。超高效液相流動相的流速為0.45 mL/min，需要運行10 min，每針運行需要4.5 mL流動相；高效液相色譜儀器流速為1.2 mL/min，運行時間40 min，每針運行需要48 mL流動相。超高效液相色譜更節(jié)約實驗耗材溶劑等，每運行一針流動相節(jié)省43.5 mL，并節(jié)約了30 min時間。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢，更經(jīng)濟和快捷。

本實驗建立的超高效液相色譜法，對加米霉素原料中加米霉素進行定性和定量測定，方法快速，可以作為企業(yè)內(nèi)控標準方法，具備精準快捷、經(jīng)濟環(huán)保的特點，能有效控制加米霉素原料的質(zhì)量。