賈玉良 綜述，陳 彬，梁文紅 審校

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義 563000；3.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室，貴州遵義 563000)

口腔鱗癌(OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)發(fā)病率的90%，OSCC病死率高，5年生存率約50%，每年新增病例超過28萬例，其中很大一部分發(fā)生在中國[1]。OSCC的發(fā)生是一個受內(nèi)源性因素和環(huán)境因素調(diào)控的多步驟過程，其中長期煙酒攝入是兩個主要的危險因素，而慢性炎癥、人類乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染、咀嚼檳榔和遺傳易感性是其發(fā)病機制的輔助因素，這些易感因素可能導(dǎo)致廣泛的遺傳和表觀遺傳改變，包括異常的DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNAs表達的改變，這些改變促進了基因組的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)展[2]。對于目前的治療策略，外科手術(shù)輔以放療或化療仍是OSCC的主要治療方法。近年來，雖然OSCC治療策略的進展提高了部分患者的療效，但預(yù)后仍不理想。因此，深入了解OSCC的發(fā)病機制，將有助于評估OSCC的進展和預(yù)后，可為OSCC的分子靶向治療提供新的思路。

1 基因啟動子甲基化的表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是指在無DNA序列改變的情況下，基因表達中任何可遺傳的改變。目前已知的表觀遺傳機制有3種主要類型:DNA甲基化、組蛋白修飾和核糖核酸干擾(RNAi)，任何一種表觀遺傳機制的破壞都會導(dǎo)致基因表達失調(diào)，從而促進癌癥和其他表觀遺傳病的發(fā)展。DNA甲基化是最常見也是研究最深入的表觀遺傳修飾，其是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化下，共價結(jié)合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位上的過程。CpG二核苷酸是發(fā)生DNA甲基化的主要位點，分散在整個基因組中的CpG二核苷酸通常聚集在0.50～4.00 kb的區(qū)域，該區(qū)域稱為CpG島，其主要部分位于腫瘤抑制基因的啟動子上[3]。啟動子區(qū)CpG島發(fā)生異常高甲基化可導(dǎo)致腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默，從而促進癌癥進展。研究表明，啟動子區(qū)CpG島的差異甲基化表型可能是OSCC發(fā)展的早期事件[4]。此外，某些基因的甲基化狀態(tài)，包括死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)1、Dickkopf相關(guān)蛋白3(DKK3)、大腫瘤抑制因子2(LATS2)等，有望成為OSCC早期檢測的生物標志物。因此，有必要進一步探討啟動子的甲基化狀態(tài)與OSCC相關(guān)基因表達間的相關(guān)性。本文就近5年研究熱門的6個OSCC基因啟動子甲基化的相關(guān)進展進行綜述，以期為臨床防治OSCC提供幫助。

2 OSCC相關(guān)啟動子甲基化基因

2.1 DAPK1

DAPK家族包含5個成員即DAPK1、DAPK2、DAPK3、DRAK1和DRAK2，其中研究最廣泛的成員是DAPK1，DAPK1是1個160×103的細胞骨架相關(guān)蛋白激酶，由1 430個殘基組成，被位于5號染色體上的DAP基因所編碼，屬于鈣/鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)調(diào)控的STK的超家族。就其大小而言，為該家族中最大的成員，并且以其作為強大的腫瘤抑制因子及細胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)劑而聞名，因此，與其他成員相比，DAPK1獲得了更多的科學(xué)關(guān)注。近期有研究表明，在大多數(shù)的癌癥中，DAPK1的表達因啟動子區(qū)CpG島高甲基化而出現(xiàn)下調(diào)，從而導(dǎo)致了癌細胞增殖[5]。CHEN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1基因啟動子中包含1個CpG島，其高甲基化可導(dǎo)致基因沉默，同時，包括OSCC在內(nèi)，已經(jīng)有多種類型的癌癥檢測到了DAPK1在CpG島上發(fā)生甲基化。此外，BHAT等[7]通過亞硫酸氫鹽基因組測序(BGS)檢測發(fā)現(xiàn)，DAPK1啟動子序列在腫瘤組織中的甲基化程度明顯高于匹配的正常組織。同樣，在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，DAPK1啟動子甲基化與OSCC呈明顯相關(guān)[8]。上述多項研究表明，DAPK1基因啟動子高甲基化可作為OSCC檢測的1個有前景的生物標志物。

2.2 DKK3

DKK3是Dickkopf Wnt信號通路抑制劑家族的最新成員，其分子量為38×103。該家族包含具有兩個不同的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白，拮抗Wnt配體，從而充當(dāng)致癌Wnt信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)劑，然而，DKK3蛋白并不拮抗Wnt蛋白，其機制目前尚不清楚。有研究表明，DKK3能有效抑制多種腫瘤的生長，其表達水平可通過DKK3啟動子基因的超甲基化下調(diào)[9]。ZHOU等[10]通過免疫組織化學(xué)(IHC)染色和半定量RT-PCR檢測DKK3在正?？谇缓蚈SCC組織中的蛋白和mRNA水平的表達，發(fā)現(xiàn)DKK3在OSCC組織中表達較強。且在OSCC中，DKK3基因表達下調(diào)由啟動子區(qū)的CpG島甲基化引起。張素欣等[11]應(yīng)用RT-PCR及甲基化特異性PCR(MSP)的方法，分別檢測OSCC組織和正常口腔黏膜組織中的DKK3基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)OSCC組織中DKK3基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)明顯高于相應(yīng)正常口腔黏膜組織，提示DKK3基因啟動子區(qū)的高甲基化狀態(tài)可能是OSCC發(fā)病的重要機制之一。有研究通過建立DKK3過表達模型，將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到OSCC來源的細胞系中，發(fā)現(xiàn)過表達的DKK3導(dǎo)致了癌細胞增殖、遷移和侵襲增加，而這種表達下調(diào)或丟失主要是由CpG島甲基化引起[12]。因此，基于這些研究結(jié)果，表明DKK3可成為OSCC早期檢測的一個潛在的腫瘤標志物。

2.3 LATS2

LATS2是Hippo信號通路中重要的調(diào)控因子，人體內(nèi)Hippo信號可以通過負性調(diào)控其下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(YAP)發(fā)揮作用。LATS2基因位于人類染色體13q11-q12，負責(zé)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，定位于中心體，通過積累微管蛋白和紡錘體的形成來調(diào)控細胞周期而發(fā)揮抑癌基因的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達的LATS2基因可明顯抑制OSCC細胞增殖并促進細胞凋亡[13]。LADIZ等[14]采用RT-PCR及MSP方法，分別對OSCC組織和正?？谇唤M織中的LATS2基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行評估，結(jié)果顯示，與正?？谇唤M織相比，OSCC組織中LATS2基因通過啟動子的甲基化而出現(xiàn)下調(diào)。韋存志等[15]研究發(fā)現(xiàn)，OSCC組織LATS2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于癌旁正常組織，且LATS2基因啟動子甲基化與LATS2 mRNA表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示LATS2基因啟動子甲基化致其基因表達受到抑制可能是OSCC的發(fā)病機制之一。文獻[13,16]研究也發(fā)現(xiàn)，OSCC中LATS2基因低表達與LATS2基因啟動子甲基化水平明顯相關(guān)，提示LATS2基因啟動子高甲基化導(dǎo)致LATS2表達下調(diào)可能是OSCC的一個發(fā)生因素。DONG等[17]證實了過表達的LATS2可以抑制OSCC的細胞增殖、克隆形成和細胞侵襲。因此，LATS2可能在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，可成為OSCC治療的潛在靶點。

2.4 婆羅雙樹樣基因(SALL)2

SALL2又稱SPALT樣轉(zhuǎn)錄因子2，是參與發(fā)育和進化過程中保守的SALL轉(zhuǎn)錄因子家族成員，該基因位于人類染色體14q11.10-q12.13。SALL蛋白的特征是沿著它們的序列存在鋅指基序，像SALL家族的其他成員一樣，SALL2亞型在整個蛋白質(zhì)中都有一個C2HC型的N端鋅指結(jié)構(gòu)域、一個富含谷氨酰胺的區(qū)域和幾個C2H2型的雙鋅指和三鋅指。此外，SALL2含有谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸富集區(qū)，這些區(qū)域通常存在于轉(zhuǎn)錄因子上。有研究表明，SALL2在多種癌癥中表達下調(diào)[18]。SUNG等[19]研究證明，SALL2的P2啟動子(包含1個功能性CpG島)在大多數(shù)原發(fā)性腫瘤中被高度甲基化。IMAI等[20]通過研究SALL2啟動子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)OSCC細胞系中SALL2的標準化甲基化值明顯高于正常細胞系，以上研究表明，CpG位點高甲基化可能是SALL2失活的機制之一，SALL2高甲基化可能在OSCC的發(fā)生中起一定作用，并可作為重要的臨床風(fēng)險評估指標。汪聰?shù)萚21]應(yīng)用qRT-PCR法檢測口腔組織中SALL2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)過表達的SALL2基因可降低OSCC細胞增殖、遷移能力，且SALL2在OSCC組織中的表達明顯低于正?？谇唤M織。因此，進一步分析SALL2將有助于明確其在OSCC中的生物學(xué)作用，以及作為早期檢測和預(yù)后標記物的應(yīng)用價值。

2.5 雙腎上腺素樣激酶1(DCLK1)

DCLK1是蛋白激酶超家族和雙皮質(zhì)素(DCX)家族的成員，基因定位于人類染色體13q13。DCLK1的結(jié)構(gòu)特點是N末端結(jié)構(gòu)域與DCX具有很高的氨基酸序列同源性(約70%)，其N-末端區(qū)域包括串聯(lián)的雙皮質(zhì)域(DCX1和DCX2)，具有驅(qū)動微管結(jié)合功能，而C-末端區(qū)域包含一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白1(CaMKI)激酶結(jié)構(gòu)域高度相關(guān)。有研究顯示，DCLK1基因啟動子甲基化在多種腫瘤中異常，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[22]。張建麗等[23]選取手術(shù)切除的OSCC組織和對應(yīng)的癌旁組織,采用MSP檢測DCLK1基因啟動子甲基化情況,結(jié)果顯示OSCC組織中DCLK1基因啟動子甲基化陽性表達與DCLK1 mRNA及蛋白表達之間均呈負相關(guān)，并且DCLK1基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān),提示DCLK1可能成為評估腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移的有效指標。KADLETZ等[24]通過使用標準的IHC技術(shù)來評估DCLK1的表達，結(jié)果顯示有54.30%的OSCC患者表達了DCLK1。因此，DCLK1基因啟動子甲基化可能成為評估腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移的有效指標，可為OSCC的治療提供一種新思路。

2.6 KN基序和錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(KANK)1

KANK1屬于KANK家族的一員，該基因位于染色體9p24.30，有一定的生長抑制作用，并可破壞β-肌動蛋白的分布。KANK1的蛋白結(jié)構(gòu)由N-末端的KN基序、保守的中心卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C-末端錨蛋白(ANK)重復(fù)域3個部分組成，其可通過這3種蛋白區(qū)域結(jié)合各種靶蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，KANK1作為一種候選的抑癌基因，在多種癌組織中低表達甚至不表達，其原因主要是啟動子區(qū)發(fā)生了異常高甲基化[25]。FAN等[26]通過檢測OSCC和正常組織中KANK1啟動子區(qū)域的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)OSCC組織中KANK1啟動子區(qū)甲基化頻率明顯高于相應(yīng)正?？谇唤M織中的甲基化頻率，且KANK1在OSCC組織中的表達較低。薛曉寒等[27]采用免疫組化SP法分別檢測KANK1在OSCC組織及正?？谇火つそM織中的表達情況時發(fā)現(xiàn)，KANK1在OSCC中的表達明顯低于正常口腔黏膜組織。這些研究結(jié)果表明，KANK1基因在OSCC中存在低表達，且這種低表達與OSCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其可作為OSCC診斷和治療的潛在靶點。

此外，近年人們正在研究和關(guān)注的還有EYA4、PAX9、STK33、GPR150、INSM1和EPHX3等眾多基因，由于檢測方法及樣本來源的不同，這些基因的啟動子甲基化頻率存在差異。雖然存在諸多差異，但多數(shù)研究表明，DAPK1、DKK3、LATS2等基因在OSCC組織中甲基化頻率較高[7，11，15]。這些基因甲基化不僅出現(xiàn)在腫瘤階段，而且在癌前病變中也能檢測到，因此，這些OSCC相關(guān)基因啟動子甲基化參與了OSCC的發(fā)生、發(fā)展過程，對其研究有利于OSCC的早期檢測和治療。

3 基因啟動子甲基化與OSCC的治療

基因啟動子甲基化的潛在可逆性為新型抗癌藥物的開發(fā)提供了機會，這些藥物可以重新激活表觀沉默的腫瘤抑制基因。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，一些DNMT抑制劑(如5-氮胞嘧啶、地西他濱等)的開發(fā)，并成功地用于治療包括OSCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤[28]。DNMT抑制劑，可有效地逆轉(zhuǎn)基因啟動子高甲基化的腫瘤發(fā)生過程，如Zebularine(Zeb)便是一種DNMT抑制劑，GAO等[29]用Zeb處理OSCC細胞后，發(fā)現(xiàn)OSCC細胞的生長受到了抑制，其表現(xiàn)為細胞生長/增殖減少，G2/M細胞周期中積累的細胞數(shù)量減少。此外，AMARAL等[30]用去甲基化藥物地西他濱(5-Aza-CdR)處理OSCC細胞后，觀察到5-Aza-CdR導(dǎo)致了O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)去甲基化，并上調(diào)了3個重要抑癌基因的轉(zhuǎn)錄。其他DNMT抑制劑，包括5-Aza-CR、天然化合物如綠茶多酚等也具有類似的抑制作用，可導(dǎo)致基因組低甲基化，并得到了廣泛的研究。

至今為止，通過手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，并根據(jù)病理結(jié)果進行輔助放療或放、化療仍然是治療OSCC的主要方式，但這些治療方式都可能導(dǎo)致嚴重的器官功能障礙。目前，OSCC的治療方式，如手術(shù)、放療、化療、光動力療法、免疫療法等，已經(jīng)導(dǎo)致了與非特異性細胞死亡相關(guān)的主要問題。因此，迫切需要OSCC治療的新方法。表觀遺傳抑制劑的開發(fā)為治療OSCC提供了一種新思路，如DNMT抑制劑，可增加放療的敏感性[31]，以及改善化療藥物的耐藥性[32]。雖然開發(fā)這類抑制劑用于OSCC治療的潛力很大，但去甲基化藥物單獨應(yīng)用于臨床的作用有限，與放療、化療或其他抑制劑結(jié)合使用是目前去甲基化治療的最佳方法。

4 展 望

近年來,隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展,以及對OSCC的研究愈加深入，越來越多的研究者認識到表觀遺傳改變特別是基因啟動子甲基化在OSCC發(fā)展過程中的重要作用。上述研究證實，基因啟動子甲基化可以調(diào)節(jié)OSCC抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，是一種很有前景的OSCC生物標志物。此外，基因啟動子甲基化狀態(tài)作為檢測OSCC的新型生物標志物，相較于癌胚抗原等傳統(tǒng)標志物顯示出了更高的靈敏度和特異度，對OSCC的臨床篩查、診斷、治療及預(yù)后具有很大的價值。

目前進行的啟動子甲基化的相關(guān)研究大多側(cè)重于單個基因位點啟動子甲基化在OSCC中的作用，但是OSCC組織中存在多基因多位點的甲基化，因此，發(fā)展和采用高通量的基因甲基化檢測方法是該領(lǐng)域的研究趨勢。眾所周知，基因啟動子甲基化是可逆的，針對這個特點，5-Aza-CdR等去甲基化藥物得以開發(fā)并應(yīng)用，但目前該藥物的給藥劑量、維持時間和不良反應(yīng)尚無定論，仍需大量試驗加以驗證。相信在不久的將來，對這些基因啟動子甲基化狀態(tài)的持續(xù)性研究，將被普遍用于指導(dǎo)OSCC的預(yù)防和治療，并為患者提供個性化治療方案。