王品雪，張金鳳，馬 麗，姚 倩，林 青,2,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)，甘肅蘭州 730046；3.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016)

人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)和胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonasfoetus)是引起貓毛滴蟲病的兩種主要病原，其中以胎兒三毛滴蟲更為常見。Levy G M等[1]首次通過分子生物學(xué)方法確定了胎兒三毛滴蟲為貓毛滴蟲病的病原。感染胎兒三毛滴蟲的貓可出現(xiàn)淋巴漿細胞性、中性粒細胞性結(jié)腸炎和慢性惡臭大腸性腹瀉[2]，一些幼貓甚至?xí)霈F(xiàn)大便失禁[3]。胎兒三毛滴蟲可寄生于多種宿主的不同部位，蟲體通過糞-口途徑傳播[2]。貓?zhí)喝蜗x的感染率視檢測方法而定，在2%～82%范圍內(nèi)不等[4-8]。感染胎兒三毛滴蟲并出現(xiàn)腹瀉癥狀的貓多為幼貓，年齡范圍為1月齡至16歲不等[2,9]。人五毛滴蟲宿主范圍廣泛，定殖于多種脊椎動物的腸道內(nèi)，呈世界性分布。人、犬和貓等不同宿主來源的人五毛滴蟲均為同一蟲種，因而存在人獸共患風(fēng)險。一般情況下，感染人五毛滴蟲并不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但當(dāng)宿主體況不佳或免疫力下降時，則會引發(fā)胃腸道反應(yīng)，造成宿主胃腸不適[10-11]。

貓毛滴蟲病作為一種臨床常見的消化道疾病，可引起貓的腹瀉，主要表現(xiàn)為頻繁排出少量液態(tài)至半成型狀態(tài)的糞便，通?；煊醒汉宛つぃ疟憔o張，對貓的健康帶來威脅，已經(jīng)引起了獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重視。近年來，病原性原蟲的檢測技術(shù)得到提升，除了常規(guī)化驗檢測以外，分子生物學(xué)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)在臨床也得到運用。本研究擬通過分子生物學(xué)方法對西安某動物醫(yī)院門診貓毛滴蟲病的感染情況進行調(diào)查，以期為該病的臨床診療和預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品來源 樣本均來自西安某動物醫(yī)院2018年-2019年來院就診貓，總計57份糞便樣品，其中春季2份、夏季21份、秋季15份和冬季19份。所有樣本均使用采便器直接從就診動物直腸內(nèi)取出，保存于生理鹽水中，并進行光學(xué)顯微鏡鏡檢。鏡檢后剩余樣品冷藏運輸回實驗室，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Diff-Quik染色液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；EZNA?Stool DNA 試劑盒(D4015-02)，OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)、TaKaRa公司產(chǎn)品；TaqDNA Polymerase，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；瓊脂糖、6×Loading buffer、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000等，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 HC-3018高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；VORTEX-5渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；TC-XP-D型PCR儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；DYY-7C電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便檢查 采集的糞便直接涂片鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下(放大倍數(shù)100×40)尋找有無運動的毛滴蟲。如未發(fā)現(xiàn)運動的蟲體，可進行染色鏡檢。按Diff-Quik染色液操作步驟進行。在光學(xué)顯微鏡下(放大倍數(shù)10×1 000)觀察結(jié)果。

1.2.2 糞便樣品DNA提取 冷凍儲存的糞便樣品解凍后按照OMEGA D4015 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit病原檢測說明書進行DNA提取，提取后的DNA置于-20℃保存，用于PCR擴增。

1.2.3 引物的設(shè)計 參考GenBank公布的人五毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AY758392.1)，用Primer Premier 5設(shè)計其特異性內(nèi)、外側(cè)引物(表1)。參考GenBank公布的胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AF466749.1)設(shè)計胎兒三毛滴蟲的外側(cè)引物，其內(nèi)側(cè)引物參照文獻[12]設(shè)計的引物序列(表1)。引物均由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。

表1 ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段的引物

1.2.4 毛滴蟲套式PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.125 μL，DNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補至25 μL。人五毛滴蟲第1輪PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，51.5℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min；第2輪PCR反應(yīng)參數(shù)將第1輪中退火溫度改為52℃，再次延伸時間改為7 min，其余條件不變。胎兒三毛滴蟲第1輪PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min；第2輪PCR反應(yīng)參數(shù)將第1輪中退火溫度改為54℃，再次延伸時間改為7 min，其余條件不變。所得PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外成像儀觀察結(jié)果。

1.2.5 DNA測序與分析 將陽性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司測序，在NCBI上進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并用MegAlign軟件將獲得的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段與已報道的參考序列進行比對分析，確定蟲種。

1.2.6 統(tǒng)計分析 利用SPSS 20.0軟件，按照不同季節(jié)和貓的年齡、性別、腹瀉癥狀、品種等不同因素對貓毛滴蟲的感染率分別進行差異顯著性分析，運用卡方檢驗和費希爾精確檢驗得出結(jié)果，當(dāng)P<0.01時，差異極顯著；P<0.05時，差異顯著；P>0.05時，差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

直腸采集的糞便立即在顯微鏡下鏡檢，可觀察到突進式運動的毛滴蟲，蟲體呈半透明的水滴樣。Diff-Quik染色后放大1 000倍可看到位于蟲體一側(cè)的波動膜與細胞核，蟲體中部有一與波動膜平行的軸桿，同時可觀察到滴蟲有4根鞭毛，其中前鞭毛3根，后鞭毛1根(圖1)。本次共收集到貓的糞便樣品57份，光學(xué)顯微鏡檢出毛滴蟲陽性樣品數(shù)為12份，即通過臨床光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果顯示，貓的毛滴蟲感染率為21.1%。

圖1 毛滴蟲光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果(1 000×)

2.2 套式PCR檢查結(jié)果

用套式PCR分別對人五毛滴蟲以及胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段進行擴增，結(jié)果與預(yù)期相同，即人五毛滴蟲片段長度為548 bp(圖2)，胎兒三毛滴蟲片段長度為348 bp(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對照；1～4.糞便樣品

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對照；1～5.糞便樣品

57份貓的糞便樣品經(jīng)套式PCR檢測，結(jié)果顯示，貓的毛滴蟲陽性樣品總數(shù)為28份，總感染率為49.1%。其中檢出人五毛滴蟲陽性樣品3份，即貓的人五毛滴蟲感染率為5.3%；檢出胎兒三毛滴蟲陽性樣品27份，即貓的胎兒三毛滴蟲感染率為47.4%；其中有2份樣品同時檢出了人五毛滴蟲和胎兒三毛滴蟲，即二者的混合感染率為3.5%(表2)。

表2 貓毛滴蟲的感染率

2.3 貓毛滴蟲感染情況的影響因素分析

本次檢測結(jié)果顯示，有人五毛滴蟲和胎兒三毛滴蟲共2種毛滴蟲的感染。但由于人五毛滴蟲陽性樣品數(shù)僅有3例，故不做統(tǒng)計分析，僅對胎兒三毛滴蟲的感染率進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，貓?zhí)喝蜗x的感染率在不同季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05)，其中，春季最高為100%，秋、冬季相對較低，分別為33.3%和31.6%。而年齡、性別、腹瀉癥狀和品種因素等均對貓?zhí)喝蜗x的感染率無顯著性影響(P>0.05)(表3、表4)。

表3 貓?zhí)喝蜗x感染情況的影響因素分析

表4 貓?zhí)喝蜗x感染情況的品種因素分析

2.4 序列比對分析結(jié)果

測序共得到11條胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段，這些片段經(jīng)Blast和MegAlign軟件比對分析，顯示與已報道的胎兒三毛滴蟲核酸序列相似性高達99%以上(圖4)。

3 討論

本次調(diào)查在西安某動物醫(yī)院就診的貓中同樣也檢出了胎兒三毛滴蟲和人五毛滴蟲，且貓?zhí)喝蜗x的感染率明顯高于人五毛滴蟲的。調(diào)查結(jié)果表明，貓?zhí)喝蜗x的感染率在不同季節(jié)的差異性顯著，其中，春季和夏季的感染率較高，而冬季的感染率最低。雖然受樣本量的影響，貓?zhí)喝蜗x易感性與季節(jié)的相關(guān)性仍需通過更多的調(diào)查與研究來明確，但是春季和夏季氣候溫暖，胎兒三毛滴蟲在濕潤的糞便中能存活較長時間[2]，這有利于毛滴蟲病的傳播。對臨床病例進行診斷時，也提示有必要基于流行季節(jié)做出預(yù)判。本次調(diào)查結(jié)果還表明，年齡、性別、腹瀉癥狀、品種等因素均對貓?zhí)喝蜗x的感染率無顯著性影響。無論幼齡貓還是成年貓均可感染胎兒三毛滴蟲。感染胎兒三毛滴蟲的貓的年齡范圍為1月齡至16歲不等[2,9]，本次調(diào)查也發(fā)現(xiàn)成年貓感染胎兒三毛滴蟲。報道稱貓?zhí)喝蜗x易感性沒有性別傾向性[4,13]。本研究結(jié)果也表明，貓?zhí)喝蜗x的感染率與貓的性別之間無顯著性關(guān)聯(lián)。腹瀉是貓毛滴蟲病的一項主要臨床表現(xiàn)，關(guān)于胎兒三毛滴蟲感染的報道多是基于患貓出現(xiàn)腹瀉癥狀后進行檢測[4,14-15]。有報道稱，腹瀉癥狀與貓?zhí)喝蜗x感染存在聯(lián)系[16-17]，也有報道稱貓?zhí)喝蜗x感染與糞便狀態(tài)無顯著聯(lián)系[5,8]。本次調(diào)查顯示，貓腹瀉表現(xiàn)與感染胎兒三毛滴蟲無顯著性關(guān)聯(lián)，考慮到樣本數(shù)量相對較少的因素，建議后續(xù)做進一步的調(diào)查研究。關(guān)于品種因素，純種貓群有感染率較高[18-19]，但純種貓和混血貓都可能感染胎兒三毛滴蟲[13]。本次調(diào)查的結(jié)果同樣顯示，不同品種的貓對胎兒三毛滴蟲的感染率無顯著性差異。

胎兒三毛滴蟲和人五毛滴蟲是毛滴蟲中的兩個重要種類，均可寄生于多種動物和人類，尤其在與人們關(guān)系最為密切的伴侶動物犬和貓中常見。盡管這兩種毛滴蟲感染后多呈亞臨床感染，但無論是考慮保護動物健康，還是關(guān)注人獸共患病的潛在傳播風(fēng)險，均需要引起人們的高度重視。