李鶴齡 ， 王 宏 ， 陳智崗 ， 宗發(fā)梁

(1. 昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 ， 云南 昆明 650500 ； 2. 云南中科靈長(zhǎng)類(lèi)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 云南 昆明 650217)

獼猴(Macacamulatta)是一種重要的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，也是研究人類(lèi)健康和疾病的理想動(dòng)物模型，在普通級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)的獼猴，都會(huì)受到寄生蟲(chóng)的侵襲，寄生蟲(chóng)感染不僅影響自身健康，也會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]。三毛滴蟲(chóng)是一種寄生于動(dòng)物腸道，引起動(dòng)物反復(fù)腹瀉，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，嚴(yán)重影響獼猴質(zhì)量，甚至危及其生命，給獼猴養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)極大的危害。截止目前，三毛滴蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究已在豬[2]、貓[3]等物種中開(kāi)展，但對(duì)獼猴源毛滴蟲(chóng)的形態(tài)和分子鑒定等方面的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)主要對(duì)獼猴腸道內(nèi)三毛滴蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并基于18S rRNA基因序列進(jìn)行分析，準(zhǔn)確鑒定出獼猴源三毛滴蟲(chóng)(Tritrichomonas)，對(duì)獼猴三毛滴蟲(chóng)的診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本 隨機(jī)采集30個(gè)飼養(yǎng)于開(kāi)放環(huán)境設(shè)施內(nèi)具有全身消瘦、脫水、糞便呈黃褐色水樣癥狀的獼猴新鮮糞便。試驗(yàn)獼猴來(lái)源于云南中科靈長(zhǎng)類(lèi)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[SCXK(滇)K2017—0001]。

1.2 儀器及試劑 普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，PCR儀(Biometra，美國(guó))，DNA電泳成套設(shè)備(Bio-Rad，美國(guó))，凝膠成像儀(AlphaImager 2200，美國(guó))。2×TaqPCR Master Mix和糞便基因組DNA提取試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；盧戈碘液染色劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 顯微鏡觀察 于載玻片中央滴1滴生理鹽水，用竹簽挑取少許糞便在生理鹽水中涂抹均勻，涂制成薄而均勻的糞膜，置于光學(xué)顯微鏡下觀察蟲(chóng)體大致形態(tài)及滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 毛滴蟲(chóng)濃集 選取低倍鏡下每個(gè)視野平均5個(gè)以上毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體的糞便樣本。用注射器輕輕吸取5 mL糞便樣本于15 mL離心管內(nèi)，加入5 mL生理鹽水，混勻，用一層滅菌紗布過(guò)濾2次，棄沉渣；再加5 mL生理鹽水與濾液混勻，分別用兩層、三層紗布各過(guò)濾2次，每次過(guò)濾后棄沉渣，3 500 r/min離心5 min。輕微搖晃，棄除上層液及中間雜質(zhì)層，取最下層管底沉積約1 mL于2 mL離心管，加1 mL生理鹽水后3 500 r/min離心5 min，棄上清液。取管底濃集的毛滴蟲(chóng)樣本用作碘液染色和DNA提取試驗(yàn)。

1.5 碘液染色 取濃集后的管底樣本10 μL于1.5 mL離心管，再加入10 μL盧戈碘液輕輕混勻，靜置30 s待蟲(chóng)體著色后吸取10 μL于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 獼猴毛滴蟲(chóng)基因組DNA提取及PCR鑒定 取濃集后的管底樣本，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取糞便基因組DNA，分光光度計(jì)測(cè)得DNA濃度>40 ng/μL，OD260/OD280值為1.7～2.0的DNA樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6.1 18S rRNA基因序列擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]中的三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因引物序列：上游引物 P1(5′-GCTCGTAGTCAGAACTGC-3′)；下游引物P2(5′-CCCAATTAGAACTCTATCTC-3′)，擴(kuò)增蟲(chóng)體18S rRNA基因序列。PCR反應(yīng)體系：1 μL 模板，12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒純化回收目的DNA，再將回收產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2 5.8S rRNA基因序列擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[5]中的五毛滴蟲(chóng)5.8S rRNA 基因引物序列：上游引物 P3(5′-TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCC-3′)；下游引物P4(5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)，擴(kuò)增蟲(chóng)體5.8S rRNA序列。PCR反應(yīng)體系參照1.6.1。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 序列比對(duì)分析與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 獲得的基因序列應(yīng)用MegAlign軟件與GenBank上已發(fā)表的相關(guān)序列經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析比較不同種來(lái)源的毛滴蟲(chóng)的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察 在高倍鏡下可看到大量梨形、月牙形或近似卵圓形且有力、快速地不停游動(dòng)的蟲(chóng)體，運(yùn)動(dòng)方向不固定，蟲(chóng)體末端有1根較粗大的軸桿突出于滋養(yǎng)體末端(圖1A)，經(jīng)碘液染色后，在油鏡下可見(jiàn)蟲(chóng)體呈卵圓形或梨形、蟲(chóng)體末段有1根鞭毛伸出體外，即為后鞭毛(圖1B)，未見(jiàn)波動(dòng)膜；在油鏡下可見(jiàn)蟲(chóng)體前鞭毛，但鞭毛數(shù)目很難在普通光學(xué)顯微鏡下判斷準(zhǔn)確(圖1C)?；谛螒B(tài)觀察，來(lái)源于獼猴腸道的毛滴蟲(chóng)可初步鑒定為猴源毛滴蟲(chóng)。

圖1 獼猴源三毛滴蟲(chóng)的鏡下觀察結(jié)果Fig.1 Microscope observation of Tritrichomonas from rhesus monkeyA：直接涂片觀察的獼猴源毛滴蟲(chóng)(40×)； B、C：碘液染色后的獼猴源毛滴蟲(chóng)(100×)A:Trichomonas from rhesus monkey by direct smear (40×)； B，C:Trichomonas from rhesus monkey stained by iodine solution(100×)

2.2 獼猴源三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因及五毛滴蟲(chóng)5.8S rRNA基因的克隆與序列分析 對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，9個(gè)樣品均獲得500～750 bp的目的基因條帶(圖2)，符合預(yù)期。將目的基因條帶純化回收后測(cè)序，獲得的猴源三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因序列大小為656 bp。

圖2 獼猴源三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of Tritrichomonas 18S rRNA gene from rhesus monkey by PCRM:DL-2 000 marker； 1～9：樣品M：DL-2 000 marker； 1-9:Samples

對(duì)五毛滴蟲(chóng)5.8S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，未獲得300～400 bp目的基因條帶。

用DNASTAR的Clustalw法將獲得的18S rRNA序列與發(fā)表在GenBank上的代表性序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)獲得的獼猴源三毛滴蟲(chóng)(編號(hào)：RM060734)18S rRNA序列與分離自腹瀉犬糞便中的胎兒三毛滴蟲(chóng)(登錄號(hào)：AY754332)相似度最高，達(dá)到了97.2%(圖3)。

圖3 獼猴源三毛滴蟲(chóng)(RM060734)與其他種源毛滴蟲(chóng)同源性比對(duì)Fig.3 Similarity comparison of Tritrichomonas between rhesus monkey(RM060734) with others

2.3 基于18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 結(jié)果如圖4所示，從獼猴糞便中分離的蟲(chóng)體與已報(bào)道的犬胎兒三毛滴蟲(chóng)18S rRNA(登錄號(hào)：AY754332)以及污水中分離的人畜共患的三毛滴蟲(chóng)18S rRNA(登錄號(hào)：KU939249)形成一個(gè)分支，而與其他的毛滴蟲(chóng)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，基于18S rRNA基因序列的分析可以鑒定來(lái)源于獼猴腸道的毛滴蟲(chóng)為猴源三毛滴蟲(chóng)。

圖4 獼猴源三毛滴蟲(chóng)(RM060734)與已報(bào)道不同種源毛滴蟲(chóng)18S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S rRNA of Tritrichomonas between isolated from rhesus monkey(RM060734) with others▲:本試驗(yàn)所得▲:Obtained in this study

3 討論

毛滴蟲(chóng)是一種微小的單細(xì)胞原生動(dòng)物。據(jù)報(bào)道，寄生于人、犬、貓、非人靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的糞便中的毛滴蟲(chóng)有胚胎三毛滴蟲(chóng)[2-3](Tritrichomonasfoetus)和人五毛滴蟲(chóng)(Pentatrichomonashominis)[6-9]。

人五毛滴蟲(chóng)主要通過(guò)污染飲用水或者食物而被動(dòng)物或者人誤食而感染，蒼蠅等也有傳播作用，感染后主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉，還會(huì)導(dǎo)致肺部感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[10-11]。三毛滴蟲(chóng)是通過(guò)糞—口途徑感染發(fā)病，導(dǎo)致腸道感染和慢性腹瀉[3,12-13],在繁殖群的牛群里面被認(rèn)為是一種重要的性傳播疾病，可導(dǎo)致母牛不孕和流產(chǎn)等[12]，三毛滴蟲(chóng)還可能是免疫缺陷病毒感染的恒河猴發(fā)生壞死性化膿性胃炎的重要輔助因子[14]。目前，有關(guān)毛滴蟲(chóng)對(duì)獼猴的致病性及采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)毛滴蟲(chóng)進(jìn)行鑒定的報(bào)道較少，所以本次對(duì)獼猴毛滴蟲(chóng)的研究為獼猴毛滴蟲(chóng)的檢測(cè)提供了參考依據(jù)。

毛滴蟲(chóng)的生命周期簡(jiǎn)單，只有滋養(yǎng)體一種形式，其典型特征是滋養(yǎng)體呈1個(gè)梨形體或近似圓形，前鞭毛2～4根或3～5根，后鞭毛1根。在不利的環(huán)境條件下，如溫度的突然變化[15]或藥物[16]存在的情況，滋養(yǎng)體有時(shí)候會(huì)發(fā)生形態(tài)改變，滋養(yǎng)體表面發(fā)生內(nèi)陷，而使鞭毛凹入滋養(yǎng)體內(nèi)部。本試驗(yàn)采集獼猴的30份糞便直接涂片觀察發(fā)現(xiàn)，有9份感染毛滴蟲(chóng)，6份感染小袋纖毛蟲(chóng)，1份感染阿米巴原蟲(chóng)，1份感染鞭蟲(chóng)，其余寄生蟲(chóng)未檢出，毛滴蟲(chóng)感染率最高。本次從獼猴體內(nèi)看到的毛滴蟲(chóng)呈蝌蚪狀，運(yùn)動(dòng)方向不固定，2～5根前鞭毛和1根后鞭毛，但鞭毛數(shù)目很難在普通光學(xué)顯微鏡下判斷準(zhǔn)確，且未發(fā)現(xiàn)三毛滴蟲(chóng)鞭毛內(nèi)陷現(xiàn)象。基于形態(tài)觀察，來(lái)源于獼猴腸道的毛滴蟲(chóng)可初步鑒定為猴源毛滴蟲(chóng)。

在蟲(chóng)種或蟲(chóng)株水平上開(kāi)展毛滴蟲(chóng)的分類(lèi)研究，對(duì)毛滴蟲(chóng)的診斷和治療等方面都具有十分重要的意義[6]，因此傳統(tǒng)的形態(tài)觀察與分子生物學(xué)研究相結(jié)合的方法對(duì)種屬的分類(lèi)鑒定更為科學(xué)[17]。本試驗(yàn)利用形態(tài)觀察及三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因和五毛滴蟲(chóng)5.8S rRNA基因分析對(duì)獼猴的毛滴蟲(chóng)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示從獼猴糞便中分離的毛滴蟲(chóng)與犬胎兒三毛滴蟲(chóng)18S rRNA基因的相似度為97.2%，并形成一個(gè)分支，而與其他的毛滴蟲(chóng)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此推斷，從獼猴糞便中分離的毛滴蟲(chóng)為三毛滴蟲(chóng)，所采樣本未發(fā)生三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)混合感染的情況。該研究方法為獼猴腸道寄生蟲(chóng)的臨床診斷提供了依據(jù)。