鐘 佳 ， 卞藝斐 ， 劉 萍 ， 周期律 ， 鐘 沅 ， 劉鐘杰

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山西 太谷 032699 ； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院 ， 山東 濟南 250355 ；3.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院 ， 浙江 臨安 311300 ； 4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

橙皮苷(Hesperidin，HSD)是一種廣泛來源于柑橘類水果的黃酮類化合物，具有抗炎、抗應(yīng)激、抗氧化、降脂和胰島素增敏等特性，有利于治療神經(jīng)、精神和心血管等疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷可改善試驗性結(jié)腸炎大鼠腸道吸收功能，緩解腸道炎癥，恢復(fù)上皮屏障完整性[2]。腸上皮參與調(diào)節(jié)病原菌誘導(dǎo)的黏膜免疫反應(yīng)，維持黏膜組織的穩(wěn)態(tài)[3]。在炎癥狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，觸發(fā)炎性細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致多種信號通路啟動，并調(diào)控炎癥基因表達的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后事件，參與炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷。本研究應(yīng)用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)炎性損傷模型，探究橙皮苷對腸上皮細(xì)胞炎性損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(B20182，HPLC≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 IEC-6細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自Biological Industries公司；LPS(L2630)，購自Sigma公司；CCK8試劑盒(CK04)，購自東仁化學(xué)科技公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性檢測試劑盒(C0017)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(438204)，購自BioLegend公司；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和IκB大鼠單克隆抗體，均購自Abcam公司。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)；高速離心機(美國Scilogex公司)；蛋白電泳儀、電泳槽(BIO-RAD公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻[4]所述方法培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞。

1.4.2 CCK-8試驗篩選橙皮苷作用濃度 IEC-6細(xì)胞以1×104個/孔接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至70%～80%融合狀態(tài)，用含不同濃度橙皮苷(0～80 μmol/L)的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后吸棄藥液，加入含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)基100 μL，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，450 nm波長檢測吸光度。

1.4.3 LDH試驗檢測IEC-6細(xì)胞膜完整性 按照1.4.2所示方法接種IEC-6細(xì)胞并用含不同濃度的橙皮苷培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL含40 μg/mL LPS的培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞上清，參照LDH檢測試劑盒說明書檢測LDH釋放量。

1.4.4 細(xì)胞劃痕試驗檢測上皮細(xì)胞細(xì)胞遷移能力 IEC-6細(xì)胞以106個/孔接種到6孔板中,當(dāng)細(xì)胞增長至70%時,培養(yǎng)基置換為含或不含20 μmol/L橙皮苷的培養(yǎng)基，預(yù)處理細(xì)胞24 h后,使用200 μL的槍頭,垂直于培養(yǎng)板劃出3條直線。PBS緩沖液清洗細(xì)胞碎片2～3次后,分別加入含或不含40 μg/mL LPS的培養(yǎng)基,并在刺激0、12 h和24 h時使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的遷移變化，每個孔選擇6個固定位點進行拍照。

1.4.5 細(xì)胞TNF-α分泌量的測定 細(xì)胞以106個/孔接種到6孔板,并培養(yǎng)至細(xì)胞達到90%單層融合狀態(tài)。用橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h，后清除培養(yǎng)基，加入100 μL含10 μg/mL LPS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞上清，根據(jù)大鼠ELISA試劑盒說明書進行炎性因子TNF-α分泌水平的測定。

1.4.6 Western blot檢測NLRP3、Caspase1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB、IκB蛋白的相對表達 經(jīng)1.4.5步驟處理后，貼壁細(xì)胞用冷PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解20 min,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。各組取蛋白質(zhì)20 μg/孔,通過10%的SDS-PAGE,半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液清洗3次，加入二抗繼續(xù)孵育1 h,ECL顯色液顯影。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理 IBM SPSS 17.0軟件對試驗結(jié)果進行分析處理。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗試驗組間差異性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 橙皮苷對IEC-6細(xì)胞活性的影響 由圖1可知，與空白對照組相比，5～80 μmol/L橙皮苷作用組IEC-6細(xì)胞活性無明顯變化(P>0.05)。選擇5、10、20、40 μmol/L和60 μmol/L橙皮苷作用濃度用于后續(xù)試驗。

圖1 橙皮苷對IEC-6細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of hesperidin on IEC-6 viability

2.2 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷的影響 由圖2可知，與空白對照組(不加LPS和HSD)相比，40 μg/mL LPS作用IEC-6細(xì)胞12 h(模型對照組)顯著增加了細(xì)胞LDH釋放率(P<0.05)。而橙皮苷(5～60 μmol/L)預(yù)處理24 h顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的LDH釋放率增加(P<0.05)。

圖2 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞LDH釋放率的影響Fig.2 Effect of hesperidin on LDH release rate in IEC-6 induced by LPS*：與空白對照組比較，P<0.05； #：與模型對照組比較，P<0.05;下圖同*:Compared with control group,P<0.05; #:Compared with LPS group, P<0.05. The same as below

2.3 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞遷移的影響 由圖3可知，與空白對照組相比，40 μg/mL LPS作用IEC-6細(xì)胞24 h顯著抑制了細(xì)胞劃痕愈合率(P<0.05)，而20 μmol/L橙皮苷預(yù)處理24 h顯著逆轉(zhuǎn)了LPS對IEC-6細(xì)胞劃痕愈合的抑制作用(P<0.05)。此外，LPS刺激細(xì)胞12 h并未引起IEC-6細(xì)胞劃痕愈合率的顯著變化(P>0.05)。

圖3 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞劃痕愈合率的影響Fig.3 Effect of hesperidin on wound closure in IEC-6 induced by LPSA：IEC-6細(xì)胞在LPS刺激12 h和24 h時細(xì)胞遷移情況(20×)； B：劃痕愈合率A:Migration of IEC-6 cells stimulated by LPS for 12 h and 24 h (20×); B:Scratch healing rate

2.4 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)炎性因子TNF-α分泌的影響 由圖4可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS刺激IEC-6細(xì)胞12 h引起TNF-α分泌水平的升高(P<0.05)，而橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預(yù)處理24 h抑制了LPS誘導(dǎo)的這種變化(P<0.05)。

圖4 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞TNF-α分泌的影響Fig.4 Effect of hesperidin on release of TNF-α in IEC-6 induced by LPS

2.5 橙皮苷對NLRP3通路蛋白表達水平的影響 由圖5可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS誘導(dǎo)pro-Caspase-1和Caspase-1的蛋白表達量，且Caspase-1/pro-Caspase-1比值顯著升高(P<0.05)。與模型對照組相比，橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預(yù)處理24 h顯著降低pro-Caspase-1 和Caspase-1(p10)蛋白表達水平及Caspase-1/pro-Caspase-1比值(P<0.05)。10 μg/mL LPS在存在或不存在橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預(yù)處理下均未引起NLRP3和IL-1β的蛋白表達量顯著改變(P>0.05)。

圖5 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞NLRP3,pro-Caspase-1，Caspase-1和 IL-1β蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of hesperidin on NLRP3,pro-Caspase-1，Caspase-1 and IL-1β protein expression in IEC-6 induced by LPS

2.6 橙皮苷對NF-κB通路蛋白表達水平的影響 由圖6可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS誘導(dǎo)p-IκB/ IκB比值顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，橙皮苷(20 μmol/L)預(yù)處理24 h顯著增加了p-IκB/ IκB比值(P<0.05)。10 μg/mL LPS在存在或不存在橙皮苷(10 μg/mL、20 μmol/L)預(yù)處理下均未引起p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表達量顯著改變(P>0.05)。

圖6 橙皮苷對LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和 IκB蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of hesperidin on p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB and IκB protein expression in IEC-6 induced by LPS

3 討論

黃酮類化合物作為一類植物源性膳食化合物，因其強大的抗氧化和抗炎作用而備受關(guān)注[5]。腸道炎作為危害牲畜健康和生產(chǎn)性能的重要疾病，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展。研究表明，橙皮苷通過其抗氧化和抗炎作用發(fā)揮保護腸道的作用[6]。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，橙皮苷能夠保護腸上皮細(xì)胞的存活，恢復(fù)上皮屏障的完整性[7]。然而，橙皮苷對LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎性損傷的作用及其作用機制還未有相關(guān)報道。本研究利用LPS刺激大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)建立體外上皮細(xì)胞炎性損傷模型，從腸上皮炎性損傷層面評估了橙皮苷在腸源細(xì)菌性疾病進程中的作用。

腸道上皮損傷與腸道病原體和細(xì)菌性毒素引起的許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橙皮苷抑制高濃度LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的LDH釋放率增加，反映了橙皮苷能夠維持腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性。另外，橙皮苷顯著逆轉(zhuǎn)了LPS對IEC-6細(xì)胞遷移能力的抑制作用，這在一定程度上說明橙皮苷有增強腸上皮單層損傷愈合的能力。

在細(xì)菌感染過程中，模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRRs)識別相應(yīng)病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)并啟動固有免疫，通過降解IκB介導(dǎo)NF-κB信號通路激活，啟動IL-1β和TNF-α等炎性因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)細(xì)胞炎性損傷。研究表明，活化的NF-κB可誘導(dǎo)細(xì)胞炎性小體形成[9]。NLRP3 炎性小體是目前研究最廣泛的炎性小體，當(dāng)NLRP3 活化后，與ASC 發(fā)生相互作用，招募Caspase-1 前體蛋白，并誘導(dǎo)自我催化，形成p20和p10亞基，進而形成具有活性的Caspase-1，成熟的Caspase-1能夠活化IL-1β和IL-18，進而誘發(fā)級聯(lián)放大炎性反應(yīng)，直接影響上皮細(xì)胞的活性與功能。研究表明，NF-κB和炎性小體在維持腸上皮屏障功能中發(fā)揮重要的作用[10]。本研究檢測了LPS作用下IEC-6細(xì)胞炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及炎性小體通路蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橙皮苷顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的Caspase-1和IκB的激活，進而抑制了炎性因子TNF-α的分泌增加。

在腸道炎癥反應(yīng)中，上皮細(xì)胞以其獨特的定位，被視作是腸道免疫的主要參與者，LPS等多種細(xì)菌致病產(chǎn)物直接作用于腸上皮細(xì)胞，廣泛激活黏膜免疫應(yīng)答，加速免疫介導(dǎo)的腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究證明了橙皮苷可以通過調(diào)控NF-κB和炎性小體通路蛋白的表達以抑制LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎性損傷，為橙皮苷等黃酮類化合物在腸源性疾病中的運用提供理論支持。