姜彥芬 ， 王金鳳 ， 孫曉霞 ， 李睿文 ， 劉立兵 ， 袁萬(wàn)哲 ， 王建昌

(1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心 , 河北 石家莊 050050 ； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071001)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一種革蘭陰性短桿菌，根據(jù)其莢膜抗原差異，可歸類為A、B、D、E、F五種血清型[1]，我國(guó)主要流行的是A、B、D三種血清型。多殺性巴氏桿菌是一種在動(dòng)物中廣泛存在的機(jī)會(huì)性致病菌，可引起禽霍亂、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎，引起山羊和綿羊呼吸道疫病，引起牛和兔出血性敗血癥，也是牛呼吸道綜合征的重要細(xì)菌性病原之一[1-2]。多殺性巴氏桿菌病多發(fā)生于春、秋季節(jié)，傳播快，死亡率高，常呈地方性流行，一旦患病，將給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，因此需要一種快速、及時(shí)準(zhǔn)確地鑒定多殺性巴氏桿菌的方法，為該病早期防控提供有效的技術(shù)支撐。

常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、且需要專業(yè)的技術(shù)人員。商業(yè)化生化鑒定卡API 20E/20 NE能夠?qū)崿F(xiàn)常見致病菌的快速、有效和便捷鑒定，但是不能有效區(qū)分多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌[3]。目前多殺性巴氏桿菌的分子生物學(xué)鑒定方法有16S rRNA測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法和重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)方法[4]，但仍需要核酸提取、靶基因擴(kuò)增或基因測(cè)序和序列比對(duì)分析等步驟，同時(shí)由于操作核酸過程中容易產(chǎn)生氣溶膠和擴(kuò)增的高靈敏性，使鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)“假陽(yáng)性”，導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌近似種的鑒定存在無(wú)法區(qū)分。

近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)作為一種新型微生物鑒定技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌、動(dòng)物源性致病菌和臨床微生物的快速鑒定[5]。其基本原理是微生物樣品與基質(zhì)在靶板上結(jié)合形成共晶體，利用激光照射共晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量使樣品解吸附，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離，經(jīng)過質(zhì)譜飛行檢測(cè)器進(jìn)行質(zhì)量分析，檢測(cè)器檢測(cè)到不同質(zhì)荷比(M/Z)的離子，并以離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，以離子峰為縱坐標(biāo)形成特異性的病原菌蛋白質(zhì)組指紋圖譜[6]，進(jìn)而與圖庫(kù)中圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)菌株種、屬乃至亞種水平的快速鑒定。本試驗(yàn)通過MALDI-TOF MS方法，對(duì)分離自突然死亡綿羊的多殺性巴氏桿菌菌株進(jìn)行鑒定，取得了與傳統(tǒng)生化方法和16S rRNA測(cè)序方法一致的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 綿羊血瓊脂平板，購(gòu)自河南安圖生物工程股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；70%甲酸、乙腈、三氟乙酸(均為色譜級(jí))，均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；無(wú)水乙醇，購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、細(xì)菌實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品(BTS)，購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；GN鑒定卡，購(gòu)自生物梅里埃美國(guó)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、HPLC超純水，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit，購(gòu)自ZYMO RESEARCH公司；pTOPO-T載體，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Autoflex speed TOF/TOF)，德國(guó)布魯克公司；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2(Compact)，美國(guó)生物梅里埃公司；ProFlexTMPCR系統(tǒng)(ProFlex)，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分離菌純化鑒定 無(wú)菌采集因口吐白沫、后肢癱瘓而突然死亡的綿羊肺臟和肝臟，用灼燒過的手術(shù)刀燙烙剖面，無(wú)菌剪刀剪開切面，將一次性無(wú)菌接種環(huán)插入深層組織刮蹭，分區(qū)平板劃線接種于綿羊血瓊脂，37 ℃低溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察可疑菌落形態(tài)和生長(zhǎng)特征。挑取24 h新鮮菌落涂片進(jìn)行革蘭染色。

1.2.2 MALDI-TOF MS對(duì)分離菌的鑒定

1.2.2.1 溶液配制 將色譜級(jí)乙腈、三氟乙酸和HPLC級(jí)超純水按照比例(500、25 μL和475 μL)配制出1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶劑，于振蕩器上充分混勻，備用。取250 μL備用標(biāo)準(zhǔn)溶劑至IVD HCCA的存液管中，室溫下渦旋混勻至黃色顆粒完全溶解，獲得基質(zhì)溶液。另取50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶劑加入到IVD BTS固體顆粒管中，反復(fù)吹打混勻溶解，室溫13 000 r/min離心2 min，移取5 μL上清液，獲得BTS溶液。

1.2.2.2 分離菌提取 將分離菌使用甲酸萃取法進(jìn)行蛋白樣本制備。在純化后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上用一次性無(wú)菌接種環(huán)取足量單菌落，重懸于裝有300 μL超純水的離心管中，用移液器反復(fù)吹打，形成均勻的混懸液。加入900 μL無(wú)水乙醇，充分混勻，靜置15 min后13 000 r/min離心2 min，棄掉上清液。繼續(xù)13 000 r/min離心2 min，吸棄上清液。室溫放置至乙醇完全揮發(fā)。然后加入50 μL 70%甲酸溶液，渦旋混勻，充分重懸細(xì)菌沉淀，再加入等體積乙腈，充分混勻。13 000 r/min離心2 min獲得離心微生物萃取物。

1.2.2.3 靶板制備 取1 μL離心后上清液加到MALDI-TOF MS靶板上，待自然干燥后，在靶板上加1 μL CHCA基質(zhì)溶液涂敷覆蓋。同時(shí)選取靶板另一位置靶點(diǎn)加1 μL BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液，干燥后，加1 μL CHCA基質(zhì)溶液涂敷覆蓋，此靶點(diǎn)用于儀器的校正。室溫下晾干時(shí)間約為15 min，將靶板送入檢測(cè)倉(cāng)待檢。

1.2.2.4 質(zhì)譜采集和結(jié)果鑒定 運(yùn)用 FlexControl 軟件對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，選擇線性操作模式和正離子模式，檢測(cè)范圍為2 000～20 000 Da。應(yīng)用BioTyper 軟件將采集樣品的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果會(huì)給出與鑒定菌最相似的10個(gè)菌種，并給出相應(yīng)分值：匹配分值在2.300以上，表示菌種鑒定可信度高(+++)；匹配分值在2.000～2.299，表示可信的菌屬鑒定和可能的菌種鑒定(++)；匹配分值在1.700～1.999，表示可能的菌屬鑒定(+)；匹配分值在0.000～1.699，表示鑒定結(jié)果不可信(-)。

1.2.3 VITEK2 Compact生化鑒定 用一次性無(wú)菌接種環(huán)挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)后的單菌落，加入3 mL 0.45% NaCl鹽水，用移液器吹吸制備菌懸液。使用濁度儀調(diào)節(jié)菌懸液濃度在0.50～0.63麥?zhǔn)蠞岫取８鶕?jù)細(xì)菌革蘭染色結(jié)果，選用VITEK 2 GN鑒定卡，應(yīng)用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4 16S rRNA測(cè)序鑒定 提取分離菌基因組DNA，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]中反應(yīng)條件進(jìn)行分離菌16S rRNA基因的擴(kuò)增，片段大小約為1 500 bp。回收目的片段，連接pTOPO-T載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化后單菌落，37 ℃搖菌，將鑒定正確的菌液送北京中科西林生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，利用 BLAST 程序?qū)Ψ蛛x菌的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 經(jīng)24 h培養(yǎng)后，綿羊血平板上可見光滑、半透明、不溶血、灰白色、露珠狀小菌落。鏡檢為革蘭陰性，短桿狀細(xì)菌。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定 通過MALDI-TOF MS 檢測(cè)及 BioTyper 軟件分析，與MALDI-TOF MS自帶數(shù)據(jù)庫(kù)中約6 000株標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)中10株多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如圖1所示，分離菌蛋白指紋圖譜基線平穩(wěn)，蛋白峰多，結(jié)果良好。分離菌鑒定為“多殺性巴氏桿菌”，匹配分值為2.371，標(biāo)記為(+++)，達(dá)到種水平的鑒定，說(shuō)明鑒定可信度高，可完全確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果及鑒定結(jié)果報(bào)告見圖2。

圖1 分離菌株MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)指紋圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS protein fingerprint of bacterial isolate

圖2 分離菌株蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison of protein fingerprint between bacterial isolate and database standard縱坐標(biāo)0.0以上為分離菌株的特征峰圖譜，以下為數(shù)據(jù)庫(kù)中多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜The characteristic peak map of the isolated bacteria was above the vertical coordinate of 0.0,the below was the standard fingerprint map of Pasteurella multocida in the database

2.3 VITEK2鑒定 通過VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，使用VITEK 2 GN鑒定卡對(duì)分離菌的48項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果鑒定為多殺性巴氏桿菌。

2.4 16S rRNA鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，凝膠電泳結(jié)果可見大小約為1 500 bp的條帶，回收目的片段，連接pTOPO-T載體，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆送菌液測(cè)序。將菌液測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的多殺性巴氏桿菌的參考株同源性在99.65%～99.79%，因此分離菌株鑒定為多殺性巴氏桿菌。

3 討論

羊巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的山羊和綿羊的一種重要傳染病，多發(fā)于綿羊，經(jīng)常突然發(fā)病，一旦發(fā)生，往往來(lái)不及治療，對(duì)羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)多殺性巴氏桿菌的快速、準(zhǔn)確鑒定，可以使飼主對(duì)病畜及時(shí)采取治療，從而阻止病情愈發(fā)嚴(yán)重。

本試驗(yàn)通過MALDI-TOF MS方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)分離自發(fā)病綿羊的多殺性巴氏桿菌的快速鑒定，結(jié)果同傳統(tǒng)的生理生化方法和經(jīng)典的16S rRNA測(cè)序方法鑒定結(jié)果一致。與傳統(tǒng)生化方法和16S rRNA測(cè)序方法相比，MALDI-TOF MS鑒定方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，能夠充分滿足疫病病原臨床診斷的要求?；趯?duì)微生物胞內(nèi)固定表達(dá)的高豐度-核糖體蛋白的分析，MALDI-TOF MS法可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物高準(zhǔn)確性和重復(fù)性的鑒定，并且不會(huì)因培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的不同而導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生較大差異[8]。在MALDI-TOF MS檢測(cè)過程中，樣品前處理簡(jiǎn)單易行，不需要基因組DNA的提取和PCR反應(yīng)擴(kuò)增，一般通過直接涂抹法或甲酸萃取法進(jìn)行樣品前處理即可；上機(jī)后1 min內(nèi)即可獲得鑒定結(jié)果；靶板一次可實(shí)現(xiàn)384個(gè)樣品高通量檢測(cè)；耗材成本低，僅需少量基質(zhì)，靶板可反復(fù)清洗使用。梁達(dá)煒等研究表明，在應(yīng)用MALDI-TOF MS法鑒定沙門氏菌過程中，成本約為VITEK2的1/3，檢測(cè)時(shí)間約為VITEK2的1/2[9]。謝田剛等研究表明，傳統(tǒng)生化鑒定方法需要3 h左右獲得對(duì)銅綠假單胞菌的鑒定結(jié)果，而MALDI-TOF MS方法則僅需要30 min左右[10]。研究表明，在樣品前處理過程中，采用直接涂抹法雖然簡(jiǎn)便，但因其容易受涂布菌量、培養(yǎng)基基質(zhì)和涂抹均勻程度的影響，導(dǎo)致圖譜重復(fù)性交叉，鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確；使用甲酸萃取法得到的蛋白指紋圖譜基線更平穩(wěn)，蛋白峰更多，重復(fù)性更好[11]。本試驗(yàn)中，從獲得純菌落到得到細(xì)菌鑒定結(jié)果，VITEK2方法需要4 h左右，16S rRNA測(cè)序方法則至少需要2 d；而 MALDI-TOF MS采用甲酸萃取法進(jìn)行樣品前處理，則僅需要約30 min即可獲得鑒定結(jié)果。

MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定的同時(shí)，還可以基于數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，對(duì)分離菌株進(jìn)行溯源[12-13]。基于質(zhì)譜儀構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)功能，可以將某一地區(qū)或農(nóng)場(chǎng)分離的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行蛋白指紋分析，獲得所有分離株的蛋白指紋圖譜后，自建該地區(qū)或農(nóng)場(chǎng)的多殺性巴氏桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)而能夠快速獲得新分離多殺性巴氏桿菌的鑒定結(jié)果，同時(shí)可以進(jìn)行細(xì)菌聚類分析。通過聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹，可以分析細(xì)菌在不同差異水平時(shí)的分型，從而進(jìn)一步分析菌株之間的親緣關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)新分離多殺性巴氏桿菌的有效溯源。這也是本課題組下一步研究的重要內(nèi)容。