邵 震 ， 蘇敬良

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100193)

鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)、鵝圓環(huán)病毒(Goose circovirus，GoCV)和鵝多瘤病毒(Goose polyomavirus，GHPV)均是商品鵝群中常見的傳染性病毒。雛鵝GPV感染自1956年發(fā)現(xiàn)以來在我國(guó)持續(xù)存在，因其傳播迅速，死亡率高而嚴(yán)重威脅著商品鵝生產(chǎn)[1-2]。GoCV和GHPV感染早期由歐洲學(xué)者發(fā)現(xiàn)和確診，近年來，我國(guó)陸續(xù)也有鵝群感染的報(bào)道。GoCV主要侵染動(dòng)物的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮組織，進(jìn)而損傷動(dòng)物機(jī)體的免疫力，使動(dòng)物更易感染條件致病性病原體[3]，發(fā)病鵝生長(zhǎng)緩慢，體重下降，尤其對(duì)肉用鵝養(yǎng)殖業(yè)危害巨大[4]。GHPV感染可引起死亡率極高的全身性致死性疾病，雖然我國(guó)尚未暴發(fā)過GHPV感染，但是從部分水禽源樣品中也檢出該病毒的存在，隨著多地從國(guó)外頻繁的引種，GHPV感染的可能性越來越高，一旦暴發(fā)將給我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)造成重大損失。

我國(guó)是世界上商品鵝養(yǎng)殖數(shù)量最多的國(guó)家，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖方式的多樣化，疾病的發(fā)生也更為頻繁和復(fù)雜，在很大程度上嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。目前大部分鵝病防控報(bào)道主要集中于雛鵝和產(chǎn)蛋鵝，對(duì)青年鵝的健康狀況了解極少。在實(shí)際生產(chǎn)中，這3種病毒經(jīng)常發(fā)生混合感染的情況，危害嚴(yán)重。因此，調(diào)查鵝養(yǎng)殖場(chǎng)這3種病毒的感染情況是非常必要的。本試驗(yàn)選擇山東某鵝場(chǎng)作為研究對(duì)象，收集屠宰后的青年鵝脾臟1 474份，采用PCR技術(shù)對(duì)樣品中GPV、GoCV和GHPV的基因片段進(jìn)行檢測(cè)，初步了解和掌握了該鵝場(chǎng)青年鵝群3種病毒的感染情況，以期為進(jìn)一步開展疾病的預(yù)防和控制研究提供可借鑒的資料。

1 材料與方法

1.1 病料 山東某鵝場(chǎng)2019年4—11月屠宰的110～120日齡鵝的脾臟。

1.2 主要試劑 E.Z.N.A.TMViral DNA Kit，購(gòu)自北京奧美德諾基因科技公司；2×TaqPCR StarMix，購(gòu)自GenStar公司；Biowest，購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；核酸染料，購(gòu)自北京中創(chuàng)宏達(dá)科技有限公司。

1.3 主要儀器 離心機(jī)，Thermo Electron Corporation產(chǎn)品；組織勻漿機(jī)，寧波新芝生物股份科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀L9600，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀DYY-6C型，北京六一儀器公司產(chǎn)品；紫外投射分析儀，北京智源通技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 病料的處理 用滅菌剪刀小心將脾臟的外部去除，取內(nèi)部組織裝入1.5 mL凍存管中，加入滅菌的PBS和鋼珠，對(duì)稱放入高通量組織研磨機(jī)中磨碎(50 Hz 30 s，每次間隔10 min，運(yùn)行4次)，待組織充分磨碎后，以13 000 g離心5 min，吸取上清液。

1.4.2 病毒DNA的提取 參照E.Z.N.A.TMViral DNA Kit試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.4.3 GPV的PCR檢測(cè) 本試驗(yàn)針對(duì)GPV基因組中編碼高度保守VP1蛋白的基因序列，以發(fā)表的GPV基因組序列(GenBank登錄號(hào)：EU583391.1)為參考設(shè)計(jì)1對(duì)引物：GPV-F(5′-CCTGGCTATAAGTATCTTGG-3′)，GPV-R(5′-GTAGATGTGGTTGTTGTAGC-3′)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為593 bp。50 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待檢DNA模板5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.4 GoCV的PCR檢測(cè) 本試驗(yàn)針對(duì)GoCV基因組中編碼保守結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列，以發(fā)表的GoCV基因組序列為參考設(shè)計(jì)1對(duì)引物：GoCV-F(5′-TAAATGCGAGTTTGATGTGTCT-3′)，GoCV-R(5′-CATTTAACCCCTTCCAAAGAGT-3′)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為564 bp。50 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待檢DNA模板5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性240 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.5 GHPV的PCR檢測(cè) 本試驗(yàn)針對(duì)GHPV基因組中編碼高度保守VP1蛋白的基因序列，以GHPV基因組序列(GenBank登錄號(hào)：MG673522.1)為參考設(shè)計(jì)1對(duì)引物：GHPV-F(5′-CAGGCAGTGACTGTTGCAACA-3′)，GHPV-R(5′-TGTGTTTTCAT

TCCGGGATGGG-3′)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為459 bp。50 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待檢DNA模板5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 病料背景 該鵝場(chǎng)種鵝從國(guó)外引進(jìn)，雛鵝為自繁自養(yǎng)，分別在1日齡和7日齡注射1次小鵝瘟抗體，10日齡和30日齡各免疫1次禽流感疫苗(H5+H7)，50日齡前后免疫1次鵝副黏病毒滅活疫苗。

2.2 本試驗(yàn)采用的PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證 為了證明本試驗(yàn)所采用的方法及所設(shè)計(jì)的引物的確可以檢測(cè)出這3種病毒的感染，本試驗(yàn)以前期獲得的3種病毒陽(yáng)性樣本為檢測(cè)對(duì)象，采用設(shè)計(jì)的引物按照上述反應(yīng)條件可成功地檢測(cè)到病毒相應(yīng)的目的條帶(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，證明了本試驗(yàn)所采取的PCR檢測(cè)方法真實(shí)有效。

圖1 PCR擴(kuò)增GHPV(A)、GoCV(B)和GPV(C)基因片段Fig.1 PCR amplification of GHPV(A), GoCV(B) and GPV(C) gene fragmentsM：DL-2 000 plus DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陰性對(duì)照； 2：本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的病毒陽(yáng)性樣本M:DL-2 000 plus DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive virus samples kept in the laboratory

2.3 病料中3種病毒的檢測(cè) 采用所建立的PCR方法對(duì)從山東地區(qū)鵝場(chǎng)收集的1 474份鵝脾臟病料進(jìn)行GPV、GoCV和GHPV檢測(cè)，結(jié)果顯示該鵝場(chǎng)有不同程度的感染(表1)。檢出的陽(yáng)性樣本總數(shù)為909份，總陽(yáng)性率為61.67%(909/1 474)。單一病毒感染陽(yáng)性率為38.74%(571/1 474)，其中GPV單一感染率為15.13%(223/1 474)；GoCV單一感染率為20.15%(297/1 474)；GHPV單一感染率為3.46%(51/1 474)。雙重感染陽(yáng)性率為16.01%(236/1 474)，其中GPV和GoCV雙重感染率為7.67%(113/1 474)；GHPV和GPV雙重感染率為4.68%(69/1 474)；GHPV和GoCV雙重感染率為3.66%(54/1 474)。檢測(cè)到GPV、GoCV和GHPV三重感染樣本102份，陽(yáng)性率為6.92%(102/1 474)。

表1 鵝脾臟樣品中GPV、GoCV和GHPV感染情況Table 1 GPV,GoCV and GHPV infections in goose spleen samples

3 討論

GPV、GoCV和GHPV是危害鵝養(yǎng)殖業(yè)的3種DNA病毒。由于GoCV和GHPV無(wú)法分離，目前除了剖檢觀察病變外，最常用的檢測(cè)方法是PCR檢測(cè)法。眼觀病變受主觀影響較大，且GoCV通常無(wú)明顯病變，大日齡鵝感染GPV后通常無(wú)明顯癥狀，GHPV癥狀較易與其他病毒混淆。綜合考慮之下，PCR檢測(cè)法相對(duì)快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。

本試驗(yàn)對(duì)該鵝場(chǎng)GPV、GoCV和GHPV感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)3種病毒的檢出率較高且存在不同程度的混合感染。其中GPV檢出率(34.40%)和GoCV檢出率(38.40%)均顯著高于GHPV檢出率(18.72%)，這較為符合GHPV尚未在我國(guó)暴發(fā)的實(shí)際情況。同時(shí)對(duì)比其他學(xué)者的研究可以發(fā)現(xiàn)，本調(diào)查中GPV單一檢出率(15.13%)低于殷奇峰[5]報(bào)道的張家口市部分地區(qū)GPV檢出率(28.30%)，王傳鈞等[6]報(bào)道的安徽地區(qū)GPV檢出率(86.11%)，龔鐸[7]報(bào)道的山東地區(qū)GPV檢出率(82.30%)，曹志全等[8]報(bào)道的儀征市GPV檢出率(48.13%)，葛凱等[9]報(bào)道的六安市GPV檢出率(33.09%)，關(guān)靜[10]報(bào)道的綏濱縣GPV檢出率(33.86%)，武世珍[11]報(bào)道的濰坊地區(qū)GPV檢出率(41.60%)和桂德旺等[12]報(bào)道的鳳臺(tái)縣GPV檢出率(34.85%)。出現(xiàn)這種情況的原因可能是該鵝場(chǎng)曾經(jīng)對(duì)鵝群進(jìn)行過大范圍的免疫接種；而且雛鵝為自繁自養(yǎng)，這可能在一定程度上降低了GPV的感染率。但是從調(diào)查結(jié)果可以看出，青年鵝群仍然存在較高的GPV感染和傳播風(fēng)險(xiǎn)，所以在引種時(shí)一定要把好檢疫檢測(cè)關(guān)，防止GPV從外輸入；應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)青年鵝群GPV抗體水平的監(jiān)測(cè)，掌握鵝群的健康狀況，一旦發(fā)現(xiàn)問題可以及時(shí)處理。

本試驗(yàn)中GoCV單一檢出率(20.15%)低于陳濟(jì)鐺等[13]報(bào)道的GoCV檢出率(44.40%)，Shehata等[14]報(bào)道的匈牙利GoCV檢出率(88.60%)和余旭平等[15]報(bào)道的浙江GoCV檢出率(35.40%)。由于GoCV的體外分離培養(yǎng)存在較大困難，所以不同日齡鵝對(duì)該病毒的易感性及該病毒的致病作用尚需進(jìn)一步研究和評(píng)估。

本試驗(yàn)中GHPV單一檢出率(3.46%)低于Miksch等[16]報(bào)道的GHPV檢出率(43.00%)，Palya等[17]報(bào)道的匈牙利GHPV檢出率(23.17%)，Gawe等[18]報(bào)道的GHPV檢出率(32.00%)，Kaszab等[19]報(bào)道的匈牙利GHPV檢出率(34.56%)和Garmyn等[20]報(bào)道的比利時(shí)GHPV檢出率(40.00%)，結(jié)果符合GHPV在我國(guó)尚未大范圍暴發(fā)這一事實(shí)，但是同時(shí)也應(yīng)該注意到正是因?yàn)槲覈?guó)尚未暴發(fā)過GHPV大流行，所以GHPV在我國(guó)的真實(shí)流行情況，是否存在大范圍的隱性感染等一系列問題還需要進(jìn)行更加深入的研究。姜甜甜等[21]曾經(jīng)從鴨病料中檢測(cè)出GHPV，這說明鴨源GHPV具有感染鵝群的潛在危險(xiǎn)，鴨群可以成為GHPV的貯藏器，所以應(yīng)該嚴(yán)防家鵝與鴨、野生水禽發(fā)生直接或間接的接觸。我國(guó)水禽資源豐富，分布廣泛，各地都有特色的品種，但是我國(guó)大部分水禽飼養(yǎng)場(chǎng)的養(yǎng)殖方式較為粗獷，養(yǎng)殖環(huán)境較為惡劣，飼養(yǎng)方式較為多樣，大部分為鴨、鵝混養(yǎng)混飼，這無(wú)疑增加了鵝感染鴨源GHPV的風(fēng)險(xiǎn)。在鴨源GHPV流行的地區(qū)，也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)鵝群GHPV流行病學(xué)的調(diào)查及預(yù)防，以防造成無(wú)法挽回的損失。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，有計(jì)劃的徹底消毒可以在一定程度上防控該病。