蔣增海 ， 鄧同煒 ， 唐光武 ， 夏艷勛 ， 何啟蓋

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 湖北 武漢 430070)

腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli)是分離于腸道外感染的大腸桿菌，例如致腎盂腎炎大腸桿菌、新生兒腦膜炎大腸桿菌、敗血型大腸桿菌，它們屬于一小部分健康群體腸道中的正常菌群，可無(wú)癥狀的定居于腸道，一旦進(jìn)入腸道外的組織，能夠高效定植，導(dǎo)致人類或者許多種類的動(dòng)物發(fā)病[1]。

在我國(guó)，腸外致病性大腸桿菌在病豬中普遍流行，造成嚴(yán)重危害。Tan等[2]報(bào)道，從我國(guó)19個(gè)省份送檢的3 127份豬肺臟、心臟、脾臟等樣品中分離到腸外致病性大腸桿菌 315株，檢出率為10.1%(315/3 127)，其中檢出率從2004年的 3.1%上升到2007年的14.6%。馬增軍等[3]報(bào)道，2013年12月—2014年7月從秦皇島地區(qū)送檢的30份高熱癥狀瀕死的豬病料中分離鑒定出8株腸外致病性大腸桿菌，檢出率為26.67%(8/30)。

本試驗(yàn)調(diào)查了河南地區(qū)豬腸外致病性大腸桿菌的流行、耐藥譜和整合子攜帶情況，分析其整合子可變區(qū)攜帶耐藥基因，旨在為本地區(qū)該病菌感染的預(yù)防和控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2016年9月—2018年12月，從鶴壁、鄭州、商丘、平頂山、許昌、新鄉(xiāng)、周口、洛陽(yáng)、開封、駐馬店和漯河等地61家豬場(chǎng)送檢的病豬中，采集肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、心血、淋巴結(jié)等病料，進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 MH(Mueller-hinto)肉湯，購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；胰蛋白酶大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白酶大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)，均購(gòu)自美國(guó)BD公司；麥康凱瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自北京奧博星生物有限公司；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管 CYZ-15e及配套試劑，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；ExTaqDNA Polymerase、dNTP Mixture、10×ExTaqBuffer(Mg2+plus)，均購(gòu)自TaKaRa公司；BM2 000 DNA Marker，購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；各種藥物，均購(gòu)自Solarbio公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 采集病豬的肺臟等病料，劃線接種于TSA平板(加有5%犢牛血清和0.01%NAD)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，挑取圓形、濕潤(rùn)、半透明、1～2 mm大小的優(yōu)勢(shì)菌落，接種于麥康凱平板進(jìn)一步純化2～3代；再挑取純化后的單菌落，接種于TSB肉湯，37 ℃搖床培養(yǎng)8～12 h，使用滅菌的甘油溶液，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 革蘭染色鏡檢 采用革蘭染色液對(duì)分離純化菌株進(jìn)行革蘭染色，在油鏡下觀察分離細(xì)菌形態(tài)特征。

1.3.3 生化試驗(yàn) 按照杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管 CYZ-15e及配套試劑說明書操作，進(jìn)行分離菌株的生化試驗(yàn)，根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果，利用腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼手冊(cè)，檢索細(xì)菌鑒定結(jié)果。

1.3.4 PCR檢測(cè) 利用水煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。參照文獻(xiàn)[4]合成1對(duì)大腸桿菌PCR檢測(cè)的特異性引物(EColi-1：5′-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′,EColi-2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′)，擴(kuò)增特異性片段大小約為264 bp。按照TaqDNA聚合酶試劑的說明書進(jìn)行PCR體系加樣。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，DNA凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 選取頭氨芐西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林/克拉維素(Amoxicillin/clavulanate，AMC)、頭孢噻呋(Ceftiofur，EFT)、頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、卡那霉素(Kanamycin,K)、鏈霉素(Streptomycin,STR)、四環(huán)素(Tetracycline,TE)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline，DOX)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(Sulfamethoxazole/trimethoprim,SXT)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SF)、黏桿菌素(Colistin，CT)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、氟苯尼考(Florfenicol,FloR)16種藥物，以大腸桿菌 (ATCC25922)為質(zhì)控菌株，依據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6],采取微量稀釋法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行豬腸外大腸桿菌分離菌株的耐藥性檢測(cè)。

1.3.6 氟苯尼考耐藥基因(floR)的檢測(cè) 參考 GenBank上公布的鼠傷寒沙門菌DT104 H3380 菌株floR基因序列(登錄號(hào):NG_047860.1)，利用Primer 5設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增floR的特異性引物(FloR-1:5′-CTCCCTGTCGTTCCAGCGAT-3′，F(xiàn)loR-2：5′-AGACGACTGGCGACTTCTCG-3′)，擴(kuò)增大小為1 114 bp，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，最后凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物送測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果通過BLAST分析，進(jìn)一步確認(rèn)floR的檢測(cè)結(jié)果。

1.3.7 Ⅰ類整合子及其基因盒的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[7]分別合成Ⅰ類整合酶基因(intⅠ)及基因盒可變區(qū)PCR擴(kuò)增引物(intI1-F：5′-GCCTTGCTGTTCTTCTACGG-3′，intI1-R：5′-GATGCCTGCTTGTTCTAC GG-3′，擴(kuò)增片段大小為558 bp；CS-F：5′-GGCATCCAAGCAGCAAGC-3′，CS-R：5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′，擴(kuò)增片段大小可變)。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55～58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳分析?；蚝锌勺儏^(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 從河南省61家豬場(chǎng)送檢的病豬中采集肺臟、肝臟、心血等樣品，共分離到大腸桿菌可疑菌株17株，檢出率為27.8%(17/61)，分別命名為KFW、WG1、KF、ZMD1、Sq2Hy、YanlinF2、Z1MF、ZMFD、ZhM1F、LKPS、ZhkouX1、ZHM2X、ZhM3X、WSX、ZMD、WSG和WG。肺臟是分離菌株的主要來(lái)源，其次是心血和肝臟。其中16株分離菌從保育仔豬中分離到，保育仔豬是最主要的感染年齡階段豬。

2.2 革蘭染色 將分離到的大腸桿菌可疑菌株進(jìn)行革蘭染色，在油鏡下觀察，均呈革蘭陰性、中等大小的桿菌(圖1)。

圖1 分離菌株的染色鏡檢結(jié)果(1 000×)Fig.1 Microscopic examination of the stained isolates(1 000×)

2.3 生化試驗(yàn) 根據(jù)分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果，利用生產(chǎn)廠家提供的腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼手冊(cè)檢索細(xì)菌鑒定結(jié)果，顯示所分離的17株細(xì)菌均為大腸桿菌。

2.4 PCR檢測(cè) 采用PCR擴(kuò)增法對(duì)分離菌株進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果表明分離菌株均能夠擴(kuò)增264 bp的特異性條帶(圖2)，進(jìn)一步驗(yàn)證分離菌株均為大腸桿菌。

圖2 分離菌株的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of the isolates M：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18:陰性對(duì)照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果如圖3所示，分離菌株對(duì)各種藥物耐藥率普遍較高，其中氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、磺胺甲噁唑、氯霉素、氟苯尼考耐藥率為100%，多黏菌素耐藥率最低為41.18%，頭孢噻呋鈉和頭孢曲松耐藥率均為47.06%，其他藥物耐藥率為58.82%～94.11%不等。由表1可知，分離菌株均為多重耐藥菌株，四重耐藥模式(如ACSuT)的菌株占100%，五重耐藥模式(如ACSSuT)的菌株占58.82%，而七重耐藥模式(如ACSSuT with amoxicillin/clavulanic acid and ceftriaxone)的菌株占35.29%。所有分離菌株都對(duì)10種以上藥物耐藥，其中3株分離菌株對(duì)16種藥物均耐藥。

表1 17株分離菌的多重耐藥譜Table 1 Multidrug resistance spectrum of 17 isolates

圖3 17株分離菌對(duì)各種藥物耐藥率Fig.3 Resistance rates of 17 isolates to various drugs

2.6 氟苯尼考耐藥基因(floR)檢測(cè) 分離菌株floR的檢測(cè)結(jié)果顯示，分離菌株floR的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性(圖4)，同時(shí)，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析進(jìn)一步確認(rèn)分離菌株攜帶floR，由此可以判定17株分離菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥表型,與其攜帶floR相符合。

圖4 分離菌株floR的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of florfenicol resistance gene floR in the isolatesM：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18:陰性對(duì)照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

2.7 Ⅰ類整合子及其基因盒的檢測(cè) 分離菌株Ⅰ類整合子及其基因盒檢測(cè)結(jié)果顯示，分離菌株均攜帶Ⅰ類整合子(圖5)，其中Sq2Hy、ZMD、ZMD1、ZhM1F和WG菌株未擴(kuò)增出基因盒可變區(qū)，其他12株菌擴(kuò)增出大小為1 000～2 000 bp的片段，通過 BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)YanlinF2、ZhM3X、ZMFD、WSX、Z1MF菌株基因盒攜帶dfrA17-aadA5耐藥基因類型，編碼產(chǎn)物對(duì)甲氧芐啶和氨基糖甙類藥物耐藥；ZhM2X、LKPS、WG1菌株基因盒攜帶aadA22-aadA23-aadA25耐藥基因類型，編碼產(chǎn)物對(duì)氨基甙類藥物耐藥；WSG、ZhKouX1、KFW菌株分別攜帶floR、dfrA12、dfrA12-aadA2耐藥基因，分別對(duì)于氟苯尼考、甲氧芐啶、甲氧芐啶-氨基糖甙類耐藥；KW菌株基因盒不攜帶耐藥基因。

圖5 分離菌株Ⅰ類整合子的整合酶基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of integrase genes in Class I integron of the isolatesM：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18：陰性對(duì)照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

3 討論

腸外致病性大腸桿菌不僅可以正常定植于腸道,而且能侵入體內(nèi)引起菌血癥,并誘發(fā)敗血癥或局部腸道外感染,如腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等[8]。本試驗(yàn)從河南61家豬場(chǎng)送檢的發(fā)病豬中共分離到17株腸外致病性大腸桿菌，檢出率為27.86%(17/61)，相比國(guó)內(nèi)其他地區(qū)檢出率稍高，如曾博等[9]報(bào)道西南地區(qū)豬腸外致病性大腸桿菌檢出率為18.5%，周磊[8]報(bào)道在安徽等五省豬場(chǎng)中腸外致病性大腸桿菌檢出率為19.2%。

多重耐藥指至少對(duì)3類抗菌藥物具有耐藥性[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，全部分離菌株均為多重耐藥菌株，如四重耐藥模式(如ACSuT)的菌株占100%，其中3株分離菌株對(duì)16種檢測(cè)藥物均耐藥，表明該地區(qū)豬源腸外大腸桿菌耐藥性十分嚴(yán)重。近年來(lái)，全國(guó)各地[11-14]報(bào)道豬源大腸桿菌對(duì)各種藥物耐藥率普遍比較高，如氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和磺胺甲噁唑等，但是對(duì)頭孢類藥物耐藥率相對(duì)低一些，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。但是與文獻(xiàn)[11-14]相比，本試驗(yàn)分離菌株對(duì)某些藥物如頭孢類藥物、氨芐西林、氯霉素等耐藥率更高。

整合子作為一個(gè)可移動(dòng)的基因元件，可定位于細(xì)菌染色體上，使細(xì)菌耐藥性發(fā)生垂直傳播，也可借助于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子在不同細(xì)菌之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株均攜帶floR耐藥基因和Ⅰ類整合子，但是有的菌株Ⅰ類整合子基因盒不攜帶耐藥基因，多數(shù)菌株攜帶dfrA17-aadA5、aadA22-aadA23-aadA25、dfrA12-aadA2等耐藥基因譜。與其他文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道相比，本試驗(yàn)分離菌株中Ⅰ類整合子陽(yáng)性率更高，表明其自身攜帶的耐藥基因更可能發(fā)生傳播的風(fēng)險(xiǎn)。氟苯尼考是目前豬場(chǎng)應(yīng)用最為廣泛的藥物之一，本試驗(yàn)分離菌株對(duì)氟苯尼考均耐藥，同時(shí)均攜帶floR，提示在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意檢測(cè)其藥物敏感性，以免造成治療失敗。