徐方蔚，陳海鵬，霍婧偉，路 晨，李盼盼，陳宇航，廖欣婷，吳力群

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100078 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院兒科，北京 100078)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以咳嗽為惟一或主要癥狀的特殊類型哮喘，也是兒童慢性咳嗽中最常見的疾病。其發(fā)病機(jī)制與典型哮喘相似，是由多種炎性細(xì)胞共同參與的氣道慢性炎癥，并由此引起的氣道高反應(yīng)性[1]。但在關(guān)于CVA動(dòng)物模型的研究中目前尚無明確區(qū)別于一般典型哮喘動(dòng)物模型建立方法的報(bào)道[2]。本課題組長期致力于兒童咳嗽變異性哮喘的臨床及基礎(chǔ)研究，參照哮喘豚鼠模型進(jìn)行改良，觀察三種CVA豚鼠造模方法在氣道反應(yīng)性、氣道炎癥和病理方面的差異，評價(jià)各模型的效度及信度。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性健康SPF級Hartley豚鼠，30只，約3周齡，體重230～280g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：[動(dòng)]SYXK(京)2019-0013。豚鼠為群居動(dòng)物不宜單籠飼養(yǎng)，按體型每籠3～5只為宜。

1.2試劑和儀器

1.2.1卵蛋白(OVA)：索萊寶(Solarbio)公司，Lot No：421C033。氫氧化鋁：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20131125。烏拉坦：SIGMA公司，批號：MFCD00007966。辣椒素：源葉生物有限公司，20mg，批號：P12D9S77366。環(huán)磷酰胺：Coolaber公司，1g，Lot No：CC29183901。

1.2.2辣椒素溶液配制:即配即用，取辣椒素，加入吐溫-80溶液、無水乙醇以及生理鹽水，配成10-4moL/L的辣椒素溶液[3]。

1.2.3乙酰甲膽堿溶液:分別配制成0.08mg/mL，0.04mg/mL和0.02mg/mL的溶液。

1.2.4霧化器:飛利浦Philips公司生產(chǎn)Sami型霧化器，霧化器輸出流量5L/min。

1.2.5小動(dòng)物肺功能儀:Ani Res2005動(dòng)物肺功能儀及分析軟件系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重由低到高分層隨機(jī)，分為4組，分別為正常對照組、模型A組、模型B組，模型C組，對照組6只，其余每組8只豚鼠。動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)[4]制定。模型A：第1天每只豚鼠注射2% OVA和200mg氫氧化鋁的混懸液1mL；第8天每只豚鼠注射0.01mg OVA和100mg氫氧化鋁的混懸液1mL加強(qiáng)致敏1次；第15天起，用1% OVA溶液霧化(霧化率3mL/min持續(xù)時(shí)間20s并逐漸延長霧化時(shí)間至90s攻擊)，隔日一次，共7次。模型B：第1天肌注4% OVA溶液0.5mL，同時(shí)腹腔注射2% Al(OH)3 0.2mL致敏；第15天起，用1% OVA溶液霧化，方法同前，隔日一次，共7次。模型C：第1天腹腔內(nèi)注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(30mg/kg),第3天每只豚鼠注射2mg OVA和200mg氫氧化鋁的混懸液1mL，第22天腹腔注射0.1mg卵蛋白和100mg氫氧化鋁混合液加強(qiáng)免疫免疫反應(yīng)；第23天起用1% OVA溶液霧化，方法同前，隔日一次，共7次。正常對照組給予同樣劑量的生理鹽水。

2.2觀察指標(biāo)

2.2.1氣道敏感性(咳嗽反應(yīng)的測定)1% OVA最后一次霧化攻擊后的第2天，將豚鼠置于密閉空間霧化吸入10-4moL/L辣椒素溶液60s，然后關(guān)掉霧化器，停留60s后掀開蓋子取出豚鼠，記錄此時(shí)開始2min內(nèi)各豚鼠的咳嗽次數(shù)。

2.2.2氣道高反應(yīng)性的測定:采用動(dòng)物肺功能檢測系統(tǒng)(PFT系統(tǒng))，觀察豚鼠氣道阻力(RI)的變化。選取20%烏拉坦溶液按1g/kg對各組豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉，備毛，分離氣管及頸外靜脈，行氣管插管并固定，分離兩側(cè)頸靜脈，穿好線備用。將豚鼠仰臥平放體描箱內(nèi)(必要時(shí)可將豚鼠頸部墊起抬高)，將氣管插管與呼吸機(jī)連接，頸外靜脈穿刺并固定，連接外接注射裝置，密封體描箱。小動(dòng)物呼吸機(jī)呼吸頻率設(shè)定為65次/min，潮氣量設(shè)定為6mL/kg。待呼吸穩(wěn)定后，測定此時(shí)基值，然后進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)試劑和順序分別為:0.5mL生理鹽水及濃度為0.02、0.04、0.08mg/mL的乙酰甲膽堿各0.5mL。每次注射后記錄下每個(gè)濃度級別下的RI值及對應(yīng)的時(shí)間，待氣道總阻力降至正常后開始下一個(gè)劑量的注射。

2.2.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù):結(jié)扎左肺門，通過氣管插管，以較小的壓力將5mL生理鹽水緩慢注入肺中，可見右肺逐漸變得膨隆、蒼白，停留30s后，緩慢回抽灌洗液，注入橙色帽管內(nèi)，重復(fù)上述操作3次。將收集的BALF進(jìn)行4℃離心，1500r/min，10min，立即取細(xì)胞沉渣進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞直接計(jì)數(shù)，并計(jì)算出嗜酸性細(xì)胞的百分率。

2.2.4肺組織HE染色:收集BALF之后快速結(jié)扎右肺門，在左心耳剪開一口，從右心房進(jìn)針進(jìn)入肺主動(dòng)脈，緩慢推入生理鹽水，將豚鼠肺中血水沖出，再用4%多聚甲醛的PBS從氣管緩慢注入，見左肺輕度膨隆即可。剪下左肺中下葉置于福爾馬林中保存固定。將固定好后的肺組織常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋，4μm切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，水干后蘇木素染色5min，清水沖洗吹干后用鹽酸乙醇分化30s，用清水浸泡15min后吹干，置伊紅液2min，再進(jìn)行脫水、透明、中性樹脂封固。參考文獻(xiàn)[5]擬定病理切片量化分級標(biāo)準(zhǔn)，主要從血管及支氣管嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、水腫及上皮細(xì)胞損傷程度三個(gè)方面進(jìn)行評價(jià)。

3 結(jié) 果

3.1豚鼠咳嗽次數(shù):各組豚鼠咳嗽次數(shù)見表1。在實(shí)驗(yàn)觀察中模型A及模型B中各有2只豚鼠在卵蛋白霧化后即出現(xiàn)明顯喘息，辣椒素刺激后亦出現(xiàn)明顯的喘咳。

表1 各組豚鼠辣椒素刺激后咳嗽次數(shù)的比較

3.2豚鼠氣道高反應(yīng)性:各組豚鼠在激發(fā)后的氣道阻力變化如圖1，每組各得到4組RL值(分別為注射生理鹽水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL時(shí)的RL值)，見表2。對比空白組，對于生理鹽水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組模型組之間兩兩比較有差異，P<0.05。在MeCh0.04mg/mL劑量下氣道阻力A組>B組>C組。

表2 不同劑量乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)氣道總阻力曲線下面積(RL-area)比較(cmH2O/mL)

圖1 各組豚鼠在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后氣道阻力變化

3.3 BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比:各組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比見表3。與空白對照組比較，3個(gè)模型組豚鼠的BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)，而3個(gè)模型組間比較中，雖然如圖2所示，模型B組的百分比增高明顯，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.051)。

圖2 各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比

表3 各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比的比較

3.4各組豚鼠肺部病理結(jié)果:空白組豚鼠氣道結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；各模型組氣道表現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞被破壞，黏膜下大量炎癥細(xì)胞浸，氣道平滑肌增生。見圖3。根據(jù)豚鼠肺部病理分級評分，空白組為(2.4±0.20)分，模型A組(6.4±0.34)分和模型B組(7.8±0.51)分以及模型C組(6.4±0.36)分，3個(gè)模型組豚鼠的肺組織病理學(xué)評分明顯升高(P<0.05)，以模型B組升高明顯，但是3個(gè)模型組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖3 各組豚鼠肺組織HE染色結(jié)果

圖4 各組豚鼠肺組織病理炎癥分級評分

4 討 論

4.1三種造模方法的比較:在造模方法上，由日本金澤大學(xué)研究并引入的咳嗽變異性哮喘豚鼠模型，給我國CVA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁┝艘粋€(gè)很好的參考[6]。但該造模方法激發(fā)時(shí)只用1%OVA霧化1次，持續(xù)90s，在本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，由于豚鼠個(gè)體差異性較大，對于激發(fā)時(shí)間有豚鼠10s即出現(xiàn)高度的氣道痙攣，如不進(jìn)行及時(shí)搶救會(huì)出現(xiàn)窒息死亡。故霧化刺激時(shí)，從10s開始逐漸適應(yīng)性延長，且CVA屬于慢性咳嗽的一種，針對慢性炎癥模型的建立方法與急性相比，主要區(qū)別在于激發(fā)時(shí)間更長。譚杰軍等[7]研究為了更好地模擬氣道慢性炎癥過程這一哮喘本質(zhì)，延長了霧化激發(fā)時(shí)間，為連續(xù)激發(fā)14d，本研究避免長時(shí)間OVA刺激而產(chǎn)生的脫敏效應(yīng)，改為OVA激發(fā)隔日一次，共7次，從而可形成典型的慢性變應(yīng)性炎癥模型。近幾年，國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)中心也在該模型基礎(chǔ)上進(jìn)行了方法上的改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)研究查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)后篩選三種CVA豚鼠造模方法，在致敏階段進(jìn)行借鑒，各方面比較見表4。

表4 三組造模方法的具體比較

4.2模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):與臨床診斷相類似，沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分咳嗽變異性哮喘和典型哮喘，目前也沒有明確的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來界定CVA動(dòng)物模型和支氣管哮喘動(dòng)物模型。因此建立與臨床癥狀相似度更高的CVA動(dòng)物模型以及合適的模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也是開展CVA研究的關(guān)鍵問題。判斷一個(gè)CVA動(dòng)物模型是否成功可以在哮喘本質(zhì)認(rèn)識的基礎(chǔ)上，看所造模型是否有如下變化：①造模后行為學(xué)表現(xiàn)(主要表現(xiàn)為刺激后咳嗽)；②肺組織HE染色是否炎性細(xì)胞浸潤，是否以嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)為代表；③BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)，重點(diǎn)是以EOS是否升高；④肺功能指標(biāo)，如RI、RL、Re等。具體判定時(shí)也應(yīng)從這三個(gè)方面與哮喘模型區(qū)分：①氣道激發(fā)試驗(yàn)時(shí)，其氣道阻力應(yīng)較哮喘輕，且氣道阻力也應(yīng)隨著激發(fā)濃度升高而逐漸上升；②肺泡灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較哮喘的少；③行為學(xué)上無明顯喘息癥狀。

哮喘動(dòng)物模型的行為學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)：共分4級，分別為呼吸困難，咳嗽，跌倒，死亡。而咳嗽變異性哮喘模型沒有明確的行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，一些研究按哮喘動(dòng)物模型的行為學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定是不準(zhǔn)確的，按照咳嗽變異性哮喘的臨床癥狀應(yīng)以咳嗽作為主要判定標(biāo)準(zhǔn)，指南[8]中推薦引起咳嗽5次的最低辣椒素濃度來對咳嗽敏感性進(jìn)行描述，而一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常采用固定辣椒素濃度進(jìn)行檢測，以咳嗽次數(shù)作為敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)，故本實(shí)驗(yàn)研究暫定5次為最小次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果中，三組模型的咳嗽次數(shù)均達(dá)到5次以上，但相比于其他類似的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，本次咳嗽次數(shù)相對較少，考慮與激發(fā)物、激發(fā)物濃度以及激發(fā)時(shí)間和觀察時(shí)間均有相關(guān)。在激發(fā)時(shí)間上不同文獻(xiàn)均有差異，王謙等[4]研究通過反復(fù)造模摸索發(fā)現(xiàn)0.5mmoL/L辣椒素霧化2min，在此條件下豚鼠咳嗽頻次計(jì)數(shù)較為可靠。大部分研究的觀察時(shí)間在2min，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，2/3的豚鼠在結(jié)束激發(fā)后并不立即出現(xiàn)咳嗽，而在2min后出現(xiàn)頻繁的咳嗽，故可將觀察時(shí)間延長為3min。

從病理切片上看，空白組豚鼠支氣管結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤；各模型組豚鼠肺組織病理表現(xiàn)：①支氣管壁局部黏膜上皮可見損傷及脫落；②各層管壁可見充血、水腫；③支氣管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，并以嗜酸性粒細(xì)胞(圖中紅色顆粒狀)為主。如圖3中所示，其中模型B損傷最重，可能與致敏藥物濃度大有關(guān)。本研究采用Underwood[8]提出用于評估抗原攻擊的豚鼠肺部炎癥變化的組織病理學(xué)評分系統(tǒng)，主要對豚鼠肺組織血管及支氣管嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、水腫、上皮細(xì)胞損傷三個(gè)方面進(jìn)行評分評估，依據(jù)每個(gè)方面的嚴(yán)重程度給予0～5分的評分，評分高的說明組織的炎癥浸潤程度也越高。三個(gè)模型組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞比例也明顯增高，說明三種方法造出的豚鼠CVA模型肺部病理上均是成功的。

在中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)呼吸學(xué)組關(guān)于CVA的診斷標(biāo)準(zhǔn)中提到患兒肺功能正常，支氣管激發(fā)試驗(yàn)提示氣道高反應(yīng)性，故有必要將小動(dòng)物肺功能檢測納入到評價(jià)指標(biāo)中。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中三組模型的氣道阻力較空白組均有增大，但模型A、B組的氣道阻力過高，結(jié)合二組中均有豚鼠出行喘息癥狀，考慮模型癥狀偏重，更類似于哮喘，而模型C組氣道阻力表現(xiàn)更為平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)的肺功能測定是通過采用有創(chuàng)的方法實(shí)現(xiàn)的，需要行頸靜脈穿刺術(shù)，將激發(fā)試劑不同濃度的乙酰甲膽堿注射入豚鼠靜脈內(nèi)，檢測其氣道阻力。實(shí)驗(yàn)前備毛，分離靜脈時(shí)盡量將包裹靜脈的筋膜剝離干凈，穿刺前注意針管的通暢，這些都影響穿刺成功率，該操作對實(shí)驗(yàn)研究人員技術(shù)要求較高，本次實(shí)驗(yàn)中B組中有2只豚鼠因穿刺術(shù)時(shí)間過長而死亡，相比Li等[9]采用無創(chuàng)方法所測定增強(qiáng)呼吸間歇(Penh)，操作簡便，對動(dòng)物傷害較少，且能重復(fù)操作，可以在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多次測定，更能體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中豚鼠氣道阻力的變化，從而有助于確定造模的時(shí)長、藥物激發(fā)濃度等等。

綜上，本試驗(yàn)研究三種模型的咳嗽癥狀和氣道高反應(yīng)性大致符合CVA的臨床癥狀的特征，其中模型A與模型B中出現(xiàn)4只明顯喘息的豚鼠，模型C的行為學(xué)表現(xiàn)和氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)更為穩(wěn)定。在BALF中嗜酸性粒細(xì)胞比例，A與C組的比例以及病理結(jié)果與臨床上咳嗽變異性哮喘和典型哮喘的差別。由此我們認(rèn)為所建立的模型C組造模方法可行性更佳，但關(guān)于CVA動(dòng)物模型的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及檢測指標(biāo)上還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究將其進(jìn)行規(guī)范。