譚薇,王眾,代芳芳,何娟,鄧志敏,程艷香

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430060)

子宮肌瘤是女性生殖器官最常見(jiàn)的良性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計(jì),育齡期的女性發(fā)病率可以達(dá)到25%[1]。盡管子宮肌瘤是良性病變,但它引起的異常子宮出血、疼痛、不孕、盆腔包塊和盆腔壓迫等癥狀,嚴(yán)重影響女性身心健康[2]。目前,子宮肌瘤的確切病因尚不清楚,其可能與遺傳和表觀遺傳機(jī)制,青春期雌激素暴露有關(guān)[3-4]。臨床上主要的治療方法為手術(shù)治療,所有肌瘤治療方法中約75%為外科手術(shù)切除,尚無(wú)有效的藥物治療以減少平滑肌瘤的大小,預(yù)防復(fù)發(fā)[5]。然而,手術(shù)治療費(fèi)用較昂貴,且較多女性懼怕手術(shù),不愿手術(shù),進(jìn)而延誤治療時(shí)機(jī)[6]。因此,迫切需求尋找臨床療效好,副作用小的藥物治療。動(dòng)物模型作為臨床前研究的載體,在藥物療效評(píng)判中的發(fā)揮著重要的作用,而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)子宮肌瘤動(dòng)物模型尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),主要有自發(fā)模型,基因工程模型,移植模型和化學(xué)誘導(dǎo)模型等。本文就國(guó)內(nèi)外子宮動(dòng)物造模的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理,比較分析其機(jī)制,模型的優(yōu)缺點(diǎn),以期為子宮肌瘤的相關(guān)研究提供參考。

1 自發(fā)模型

自然界有許多動(dòng)物可以出現(xiàn)與人類相類似的疾病表現(xiàn)。目前,具有子宮平滑肌瘤自發(fā)傾向的動(dòng)物有Eker雌鼠[7]、鵪鶉[8]、美國(guó)大肚子豬[9]以及小型寵物豬[10]等。國(guó)外較為公認(rèn)且應(yīng)用廣泛的主要是Eker雌鼠,大約65%的Eker大鼠有結(jié)節(jié)性硬化癥2(tuberous sclerosis 2,Tsc2)抑癌基因的種系突變,其在12～16個(gè)月大的時(shí)候自發(fā)發(fā)展成子宮平滑肌瘤[11]。與人類子宮肌瘤相似,Eker大鼠肌瘤對(duì)雌激素高度敏感,并具有相似的生化和表型特征,如表達(dá)性類固醇激素受體,高遷移率蛋白A2抗體,胰島素樣生長(zhǎng)因子失調(diào)和參與雷帕霉素靶蛋白調(diào)控途徑等。此外,原代提取的Eker雌鼠腫瘤細(xì)胞(ELT3細(xì)胞),可保留其子宮肌瘤相關(guān)表型,這些特性使其廣泛作為體外實(shí)驗(yàn)研究模型,用于疾病藥物療效的評(píng)估[12]。目前,Eker大鼠模型廣泛用于研究生命早期環(huán)境暴露對(duì)子宮肌瘤發(fā)病率的影響,以及可能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,以建立針對(duì)性的預(yù)防干預(yù)措施,降低子宮肌瘤的發(fā)病率[13-16]。該模型無(wú)需任何干預(yù)處理,與人類子宮肌瘤具有極其相似的病理改變,但造模時(shí)間長(zhǎng),價(jià)格昂貴,且Eker雌鼠容易患腎癌和肝癌,可能對(duì)肌瘤的臨床表征產(chǎn)生一定的影響[17-18]。

2 轉(zhuǎn)基因模型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為研究肌瘤的發(fā)展以及藥物的靶點(diǎn)提供了新的手段。小鼠Tsc2基因整體缺失容易導(dǎo)致早期胚胎死亡,而表達(dá)由孕激素受體驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶的Tsc2雜交小鼠死亡率低。研究者將敲除Tsc2的小鼠(基因型為Tsc2flox/flox)與表達(dá)Cre重組酶的小鼠(基因型為PRCre/Cre)雜交得到基因型為PRCre/+/Tsc2flox/+的小鼠。將這些雜交小鼠與基因型為Tsc2flox/flox的雌性或者雄性小鼠進(jìn)行雜交,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)篩選出基因型為PRCre/+/Tsc2flox/flox的小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在3～36周之間處死動(dòng)物,解剖子宮進(jìn)行HE染色以及免疫組化檢查發(fā)現(xiàn),幾乎所有的雜交小鼠在12周出現(xiàn)子宮肌層的增厚,在24周出現(xiàn)子宮肌瘤,這些子宮肌瘤在病理以及生化特征上與人類子宮肌瘤相似[19]。另一研究者 Kaneko等[20]將 Tsc2tml.lMjg小鼠與Amhr2tm3(cre)Bhr小鼠雜交,得到了子宮特異性Tsc2缺失的小鼠模型(Tsc2cKO),這些小鼠也表現(xiàn)出子宮肌層的增大,但并未形成肌瘤。由于Tsc2主要作用于mTORC1/S6信號(hào)通路,故Tsc2基因敲除小鼠主要用于研究抑制mTORC1/S6通路的相關(guān)藥物的療效[20]。

人類介體復(fù)合物亞基12(mediator complex subunit 12,Med12)基因體細(xì)胞突變與子宮肌瘤的高發(fā)生率密切相關(guān),是人類肌瘤病變中檢測(cè)到的最常見(jiàn)的DNA突變。Med12位于X染色體上,參與RNA聚合酶II復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[21]。Mittal等[22]將Med12 c.131G>A錯(cuò)義突變基因整合到常染色體上構(gòu)建小鼠動(dòng)物模型,敲除或者不敲除小鼠位于X染色體上的自體Med12基因,結(jié)果表明Med12 c.131G>A錯(cuò)義突變體在兩種情況下都會(huì)引起子宮肌瘤的發(fā)生,但在敲除X染色體上的Med12基因的條件下,小鼠子宮肌瘤成功率達(dá)到80%,病變發(fā)生更早,且肌瘤體積更大。轉(zhuǎn)基因模型突破了種系隔離,可以方便進(jìn)行更廣泛的基因研究,去研究一些人類具有而動(dòng)物不具有的基因[23]。特征性的敲除和整合基因,可以精確的研究基因在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制,但轉(zhuǎn)基因模型操作難度大,價(jià)格昂貴。此外,人子宮肌瘤的遺傳學(xué)改變遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止上述2個(gè)基因,突變形式也多種多樣,因而,仍需繼續(xù)探索其它的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,更好的了解肌瘤的遺傳發(fā)病機(jī)制。

3 移植瘤模型

3.1 組織塊移植

隨著器官移植的發(fā)展,國(guó)外逐漸以免疫缺陷動(dòng)物作為子宮肌瘤的移植模型,常見(jiàn)的移植模型主要由腹膜移植,皮下移植以及腎膜下移植。Corachán等[24]將臨床上獲取的人體子宮肌瘤組織切成3～4 mm3的片段,移植到5周大的雌性非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe non-obese diabetes combined with immunodeficiency,NOD/SCID)的小鼠腹膜中,并在小鼠頸部皮下植入17β雌二醇(17βestradiol)緩釋丸(每丸0.36 mg,持續(xù)60 d被完全吸收),每隔2周使用1 mg/d的孕酮治療小鼠1周,通過(guò)使用PET/CT體內(nèi)檢測(cè)異種抑制物,最后解剖子宮,卡尺計(jì)算肌瘤大小,HE染色以及免疫組化染色證實(shí)小鼠肌瘤造模構(gòu)建成功。Nair等[25]在NODSCID小鼠背側(cè)做切口切除雙側(cè)卵巢,切除后3周,使用套管針將臨床子宮肌瘤組織樣品進(jìn)行皮下移植,并皮下植入雌二醇緩釋丸(每丸0.1 mg,持續(xù)60 d被完全吸收)。Ishikawa等[26]在NOD/SCID小鼠擁有豐富血液供應(yīng)的腎包膜下移植入子宮肌瘤組織,結(jié)果顯示正常子宮肌層組織和子宮肌瘤組織的存活率接近100%。除了NOD/SCID小鼠外,BALB/c裸鼠也可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在BALB/c裸鼠的背部或者腹部進(jìn)行臨床肌瘤組織塊移植,均可造模成功[27-28]。

由于免疫缺陷小鼠昂貴,對(duì)無(wú)菌條件要求較為嚴(yán)格,培育困難,Sousa等[29]提出通過(guò)對(duì)SPF級(jí)Wistar大鼠連續(xù)給予免疫抑制劑麥考酚酯灌胃兩周以構(gòu)建免疫抑制模型,可顯著降低實(shí)驗(yàn)成本,且其對(duì)手術(shù)的耐受性顯著強(qiáng)于免疫缺陷鼠。此外,研究比較了腹膜下移植與皮下移植的成功率,結(jié)果表明,子宮肌瘤腹膜下移植模型的成功率要高于皮下移植模型,且腹膜下移植比皮下移植更為有效。宋陽(yáng)等[30],甄玉花[31]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良,于子宮肌瘤移植前3 d予以芬嗎通灌胃(每日雌激素0.4 mg/kg,孕激素2 mg/kg),然后在小鼠腹部做一縱行切口,將臨床樣品的肌瘤組織縫合至腹膜上,術(shù)后繼續(xù)予以麥考酚酯,芬嗎通灌胃,其造模成功率達(dá)90%。人子宮肌瘤異種移植模型保留了人子宮平滑肌瘤的解剖學(xué),組織學(xué)和生物學(xué)的特征,廣泛用于藥物的臨床前研究,用來(lái)評(píng)估療效以及毒理作用,也適用于評(píng)估射頻消融等介入治療對(duì)肌瘤的療效。手術(shù)移植瘤模型相對(duì)于轉(zhuǎn)基因模型操作簡(jiǎn)單,且造模成功率顯著強(qiáng)于其它造模方法,近幾年為國(guó)內(nèi)外所推崇。

3.2 細(xì)胞移植

組織塊移植造模成功率高,且異種移植瘤保留了原組織的組織學(xué)特征,但大多需要復(fù)雜的手術(shù)操作,對(duì)小鼠的創(chuàng)傷大。此外,異種組織塊移植需要從臨床上獲取新鮮的肌瘤樣品,并非始終可行,且患者的差異和肌瘤的差異都有可能對(duì)造模成功率產(chǎn)生影響。而細(xì)胞移植操作簡(jiǎn)單,單一樣品來(lái)源,皮下注射細(xì)胞即可,減少了小鼠的手術(shù)損傷。細(xì)胞移植方法主要利用5～6周SPF級(jí)雌性無(wú)胸腺裸鼠,皮下注射17β雌二醇緩釋丸(1.7 mg,持續(xù)90 d)并在注射4 d后,將小鼠麻醉皮下注射ELT-3細(xì)胞(1×107個(gè)),3～4周后小鼠每周體內(nèi)注射熒光素(150 mg/kg),使用非侵入式體內(nèi)成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),每隔3 d用卡尺測(cè)量小鼠的肌瘤體積大小,驗(yàn)證異位移植瘤是否構(gòu)建成功[32-36]。除皮下移植外,也可以將原代子宮肌瘤細(xì)胞移植入切除卵巢的雌性NOD/SCID小鼠的腎囊與腎實(shí)質(zhì)之間,同時(shí)皮下植入緩釋劑雌二醇加孕酮激素藥丸,造模成功率優(yōu)于皮下移植[37-38]。由于細(xì)胞移植造模成功率較低,且異種移植物生存期較短,一般僅能存活8周。Malik等[39]就前人的基礎(chǔ)對(duì)細(xì)胞移植物培育方式進(jìn)行改良,由之前的2D培育(培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞)轉(zhuǎn)為3D培育(將細(xì)胞放在類似體內(nèi)組織支架的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白制成的基質(zhì)中生長(zhǎng),允許細(xì)胞附著,遷移增殖與分化),將培養(yǎng)得到的細(xì)胞皮下移植到去除卵巢的免疫缺陷小鼠中,構(gòu)建模型,細(xì)胞異種移植物生存時(shí)間可以延長(zhǎng)至12周,且造模成功率>90%。細(xì)胞移植模型主要用于研究藥物對(duì)肌瘤平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響,也可評(píng)價(jià)藥物對(duì)肌瘤的療效與毒害作用,常與細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合一起進(jìn)行研究,但存活周期短以及造模成功率低仍是需要繼續(xù)解決的問(wèn)題。

4 誘發(fā)模型

普遍認(rèn)為,子宮肌瘤生長(zhǎng)與雌激素過(guò)高密切相關(guān),因此,育齡期好發(fā)肌瘤,而絕經(jīng)后女性的子宮肌瘤發(fā)病率明顯下降,甚至原有的子宮肌瘤也會(huì)痊愈。朱焰等[40]采用去除卵巢后加單一雌激素誘導(dǎo)法構(gòu)建子宮肌瘤動(dòng)物模型,麻醉雌性豚鼠后摘取卵巢,術(shù)后20 d,分別皮下注射劑量雌激素每只50 g(每周2次),每只50 g(每周3次),每只100 g(每周2次),每只100 g(每周3次),于實(shí)驗(yàn)的第8、12和16周分別處死動(dòng)物,觀察子宮和肌瘤的形態(tài),并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示,雌激素誘導(dǎo)的劑量與肌瘤發(fā)生率呈正相關(guān),而雌激素誘導(dǎo)頻率與動(dòng)物死亡率正相關(guān),其整體造模成功率為60%。單一的雌激素造?？梢悦芮械挠^察雌激素在肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,但相較于單一的雌激素誘導(dǎo)造模法,雌孕激素聯(lián)合造模法造模更穩(wěn)定,成功率更高,更加符合子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,容易觀察到藥物的療效目前國(guó)內(nèi)主要采用雌孕激素聯(lián)合造模法。

鄒小麗等[41]取未孕的SPF級(jí)SD雌性大鼠,腹腔注射苯甲酸雌二醇0.0005 mg/g(每天1次),連續(xù)25 d后改為腹腔注射黃體酮注射液0.004 mg/g(每天1次),連續(xù)5次。造模完成后第2天處死大鼠,子宮平滑肌層病理結(jié)果顯示局部平滑肌增殖活躍,和臨床子宮肌瘤病理組織學(xué)很相似,造模成功。同樣使用SD系雌性未孕小鼠進(jìn)行造模,不同研究者用的劑量也有少許差別。鄭冬雪等[42]采用腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg(每天1次),4 mg/kg黃體酮注射液(每周1次),連續(xù)30 d,最后5 d兩種激素同時(shí)注射的方法成功造模。此外,還可以通過(guò)上午灌胃給與己烯雌酚1.35 mg/kg,同時(shí)肌注每2 d 1 mg黃體酮共5周進(jìn)行短時(shí)造模[43-44]。

相較于短時(shí)造模,長(zhǎng)期造模效果更好,且更符合子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。徐秋霞[43]周一、周三及周五給與小鼠灌胃處理(0.167 mg/kg),另每周日肌注黃體酮注射液每只1.1 mg,共20周進(jìn)行長(zhǎng)期造模。陳嘉等[45]對(duì)SD雌性大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除后,肌注苯甲酸雌二醇(每只0.1 mg,每周3次),第八周開(kāi)始肌注黃體酮(每只1 mg,每周1次),共11周造模結(jié)束。

除SD系小鼠,常見(jiàn)的還有Wistar大鼠模型,通過(guò)對(duì)Wistar大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/kg,以及黃體酮1 mg,連續(xù)7 d,可制備短時(shí)子宮肌瘤大鼠模型[46]。長(zhǎng)期造模主要通過(guò)對(duì)Wistar大鼠肌注苯甲酸雌二醇(每只0.12 mg,每周3次)和黃體酮(每只1 mg,每周1次),共16周進(jìn)行造模[47]。激素誘導(dǎo)模型更符合人肌瘤生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程,肌瘤自體生長(zhǎng),造模方法簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉,廣泛用于藥物的臨床前研究以及疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制。但誘導(dǎo)模型中關(guān)于大小鼠類型的選取,藥物的劑量、用法、注射頻率以及造模周期沒(méi)有統(tǒng)一的指標(biāo),且造模成功率一般低于80%,因而,仍需繼續(xù)探索更有效的激素誘導(dǎo)模型。

5 結(jié)語(yǔ)

子宮肌瘤是子宮平滑肌組織增生而形成的良性腫瘤,其發(fā)病率難以準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)。研究統(tǒng)計(jì),育齡期婦女的患病率可達(dá)25%,根據(jù)尸體解剖統(tǒng)計(jì),其發(fā)病率可達(dá)50%以上[1]。隨著時(shí)代的發(fā)展,越來(lái)越多的女性生育年齡推遲,有生育要求的子宮肌瘤患者也越來(lái)越多,子宮切除術(shù)剝奪了女性的生育能力,而肌瘤剔除術(shù)容易造成盆腔粘連且容易復(fù)發(fā),在一定程度上損害了女性的生育能力。因此,開(kāi)發(fā)有效的藥物治療對(duì)提高患者的生活質(zhì)量,減輕患者以及醫(yī)療保健的負(fù)擔(dān)至關(guān)重要。而動(dòng)物模型是藥物前臨床療效評(píng)估不可缺少的部分,然而,目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于構(gòu)建子宮肌瘤動(dòng)物模型尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

總結(jié)國(guó)內(nèi)外子宮肌瘤動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn),國(guó)外主要以Eker大鼠和移植瘤模型為主。雖然這些方法一定程度提高了造模的成功率,但仍有一定的局限性。Eker大鼠在國(guó)內(nèi)難以購(gòu)買,且價(jià)格昂貴,同時(shí)容易自發(fā)腎癌,可能會(huì)對(duì)肌瘤有所影響,且長(zhǎng)期培育困難,但在研究環(huán)境暴露對(duì)肌瘤發(fā)病率的影響以及表觀遺傳調(diào)控方面的優(yōu)勢(shì)無(wú)可替代;轉(zhuǎn)基因小鼠模型,操作難度大,價(jià)格極其昂貴,但轉(zhuǎn)基因模型突破了種系障礙,適用于深入研究遺傳學(xué)相關(guān)基因改變及通路機(jī)制;單基因突變構(gòu)建的模型有利于研究藥物的精確靶點(diǎn),但單純的單基因突變與臨床肌瘤模型可能存在出入;移植瘤模型需要免疫缺陷動(dòng)物,而免疫缺陷動(dòng)物價(jià)格昂貴,為了避免感染,培育要求常比較苛刻,且小鼠對(duì)手術(shù)的耐受性也不高。相較之下,近幾年提出的使用免疫抑制劑構(gòu)建大鼠免疫缺陷模型,降低了實(shí)驗(yàn)成本,提高了大鼠對(duì)手術(shù)的耐受性,廣泛用于藥物的臨床前研究,也適用于射頻消融等微創(chuàng)方法療效的檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)主要采用雌孕激素聯(lián)合誘導(dǎo)的方法,采用雌激素單模法和雌孕激素雙模法構(gòu)建動(dòng)物模型。雙模法構(gòu)建的動(dòng)物模型子宮肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)更為活躍,模型更為穩(wěn)定,與子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制更為吻合,綜合評(píng)價(jià)優(yōu)于單模法。目前國(guó)內(nèi)主要以雙模法構(gòu)建動(dòng)物模型為主,然而建模中關(guān)于藥物的劑量、用法、注射頻率以及造模周期沒(méi)有統(tǒng)一的指標(biāo)。相較于其它造模方法,雌孕激素聯(lián)合誘導(dǎo)法肌瘤自體生長(zhǎng),操作簡(jiǎn)單,價(jià)格更為低廉,且長(zhǎng)程造模更符合臨床子宮肌瘤的發(fā)展過(guò)程,在研究疾病的病理生理過(guò)程及藥物的療效及毒理作用方面不可替代,但造模成功率相對(duì)其它模型稍低,造模時(shí)間接近于其它方法時(shí)長(zhǎng)的2倍。綜上,每種造模方法對(duì)研究肌瘤的發(fā)病機(jī)制以及評(píng)價(jià)藥物的療效都提供了幫助,但皆有利弊,仍需繼續(xù)探索新的動(dòng)物模型服務(wù)于臨床,方便研究者們根據(jù)每種模型的特點(diǎn)選取合適的方法進(jìn)行造模,推進(jìn)對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)。