蒙健林,梁健芬,張興博,文銘鈞,鄧仙勇

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530023;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530023)

帕金森病(Parkinson disease,PD)又稱為震顫麻痹(paralysis agitans),是一種世界范圍內(nèi)普遍存在的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,影響到3.7%的65歲以上人口[1]。臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙為主要特征[2]。PD的病因尚不清楚,盡管研究表明其病因涉及多因素,如遺傳、環(huán)境和衰老等[3]。帕金森病的主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性丟失,因此,帕金森動物模型制備的主要思路是利用化學(xué)、物理等方法來破壞黑質(zhì)-紋狀體多巴胺遞質(zhì)神經(jīng)系統(tǒng),使其神經(jīng)元變性丟失,從而產(chǎn)生帕金森病特異性的病理改變[4]。目前常用的帕金森病動物模型主要包括:(1)化學(xué)損毀因素制備的帕金森病動物模型,如1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)、6-羥 基 多 巴 胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、魚藤酮(totenone)、百枯草(paraquat,PQ)等制備的模型;(2)機(jī)械、物理損毀因素制備的帕金森病動物模型;(3)基因工程技術(shù)制備的動物模型[5]。這些模型能夠在一定程度上再現(xiàn)包括運(yùn)動缺陷、黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和路易體形成等在內(nèi)的帕金森病主要生理、病理特征[6]。可用于建立PD模型的動物種類繁多,每種動物都有不同的優(yōu)點(diǎn)和局限性。此外,基于細(xì)胞的模型也成為PD研究的模型。本文總結(jié)了近年來PD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)展并對其做出評價。

1 化學(xué)損毀因素制備的帕金森病動物模型

1.1 1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)模型

研究表明MPTP是合成海洛因的毒性成分之一,此前有報道稱加利福尼亞的一些海洛因吸食者出現(xiàn)高度相似于帕金森病的癥狀[7]。MPTP已被用于誘導(dǎo)無脊椎動物和脊椎動物多巴胺能變性,后者包括非人類靈長類動物、小型豬、大鼠等[8]。MPTP是一種親脂性化合物,可以穿越血-腦屏障(bloodbrain barrier,BBB),一旦進(jìn)入大腦,會被單胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAO-B)代謝為強(qiáng)效的多巴胺能神經(jīng)毒素MPP+,多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體主動將MPP+攝取到多巴胺能神經(jīng)元的線粒體內(nèi),使線粒體復(fù)合物的活性受到抑制,從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡[9]。例如,MPTP通過靶向線粒體來誘導(dǎo)PD樣病理,因此,它是研究線粒體功能障礙的有用模型[10]。MPTP病變模型總體上具有顯著的運(yùn)用價值,其優(yōu)點(diǎn)在于它對黑質(zhì)致密部和紋狀體均有較強(qiáng)的敏感性,可以應(yīng)用于PD發(fā)病過程中線粒體復(fù)合物活性受到抑制等相關(guān)方面的研究;并且MPTP誘導(dǎo)的PD動物模型能夠較為準(zhǔn)確地模擬出PD病人的運(yùn)動障礙癥狀[11]。然而,MPTP方法并沒有完全復(fù)制動物的PD病理[12]。MPTP動物模型不能復(fù)制PD的多系統(tǒng)病理,也不能形成細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚集體[13],也很難觀察到路易小體的產(chǎn)生[14]。用藥量和方法不同均對MPTP模型的造模結(jié)果有較大影響[15],在小鼠中可能導(dǎo)致高死亡率、行為和生化結(jié)果的可變性、以及小鼠自身能過對MPTP造成的病理損害進(jìn)行一定的自發(fā)修復(fù)[16-17]。

1.1.1 MPTP猴模型

在醫(yī)學(xué)研究中,非人類靈長動物(non-human primates,NHP)在提供對疾病機(jī)制的重要見解方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用,因?yàn)镹HP與人類的遺傳和生理密切相關(guān)[18]。通常多用獼猴、食蟹猴等,在血管造影下注入MPTP的介入法和分離頸動脈分叉部,夾閉頸外動脈,穿刺頸總動脈注藥的手術(shù)方法,均可制作滿意的猴偏側(cè)PD模型[19]。此外,MPTP損傷的猴子在基于電路調(diào)制的新的對癥治療方法中起著至關(guān)重要的作用[20]。NHP帕金森病癥狀可通過給藥神經(jīng)毒素或攜帶異?；虻牟《据d體產(chǎn)生。表型的嚴(yán)重程度可以通過一個統(tǒng)一的帕金森病評定量表(UPDRS)來測量,但是對NHP的評估還沒有標(biāo)準(zhǔn)化[21]。NHP模型表現(xiàn)出像人類一樣的癥狀,例如獼猴表現(xiàn)出左旋多巴引起的運(yùn)動障礙,類似于人類的舞蹈肌張力障礙?？梢酝ㄟ^塔式跳躍實(shí)驗(yàn)和沙漏實(shí)驗(yàn)評估NHP的運(yùn)動障礙和軸向剛度。此外,與嚙齒動物相比,獼猴更好地復(fù)制人類的睡眠模式,這使得它成為研究睡眠或社會行為相關(guān)癥狀的優(yōu)越模型[22]。然而,由于NHP的研究需要大量的勞動力和費(fèi)用以及面臨倫理考驗(yàn),故一般僅用于臨床前評估治療[23]。

1.1.2 MPTP小鼠模型

與靈長類動物相比,嚙齒類動物具有價格便宜、易于控制等特點(diǎn),小鼠模型適合于研究MPTP的毒性機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)性藥物的研發(fā),目前MPTP小鼠模型已經(jīng)被廣泛用于帕金森病的實(shí)驗(yàn)治療。根據(jù)研究目的不同,MPTP小鼠模型的制備方式分為4種:(1)癥狀前帕金森病模型:小劑量MPTP(10～20 mg/kg),一次腹腔注射,適合研究代償機(jī)制;(2)急性帕金森病模型,20 mg/kg的MPTP間斷腹腔注射4次,每間隔2 h,導(dǎo)致細(xì)胞快速壞死;(3)亞急性帕金森模型,20～30 mg/kg的MPTP注射,1次/天,連續(xù)5 d,導(dǎo)致緩慢的細(xì)胞凋亡;(4)慢性帕金森病模型,MPTP劑量為4 mg/kg,1次/天,連續(xù)20 d。MPTP損傷的模型小鼠在急性中毒期表現(xiàn)出瞳孔散大、豎毛、唾液過多及陣攣性的癲癇發(fā)作等癥狀,一般出現(xiàn)在注射后的15～30 min內(nèi),但可很快恢復(fù)正常[24]。有的實(shí)驗(yàn)則觀察不到這些行為改變,這可能與小鼠種屬、年齡、藥量等MPTP敏感性的不同相關(guān)。因而盡管模型小鼠有自主活動減少的癥狀,但很少能見到長時間典型的帕金森病運(yùn)動障礙。

1.2 6-羥多巴(6-OHDA)模型

6-OHDA是一種兒茶酚胺選擇性神經(jīng)毒素,能夠通過多巴胺或去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入神經(jīng)元。6-OHDA模型在PD研究中得到了廣泛的應(yīng)用,其誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動物具有一致的行為表型并且6-OHDA模型能夠預(yù)測多巴胺能神經(jīng)元的變性[25]。6-OHDA模型的優(yōu)點(diǎn)在于其能過選擇性搗毀黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元,不會影響其它的神經(jīng)元,因此可有效用于研究治療PD藥物療效。其缺點(diǎn)在于6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病動物模型最主要的運(yùn)動障礙表現(xiàn)是偏側(cè)旋轉(zhuǎn),不能很好地模擬出PD常見的臨床癥狀如靜止性震顫、運(yùn)動功能減弱、肌肉僵直及四肢拘攣等。6-OHDA模型是造模時間短的急性損傷模型,不能表現(xiàn)人類帕金森病病情進(jìn)展緩慢、病程長的特點(diǎn)。該模型也不能表現(xiàn)出帕金森病的一大基本病理特征:路易小體(Lewy bodies)的聚集[26]。利用6-OHDA構(gòu)建PD模型最常見的三種注射靶點(diǎn)是黑質(zhì)、內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)和紋狀體。在MFB中注射6-OHDA是獲得顯著可再生的多巴胺能變性模型的首選方法,即使在很長的生存時間內(nèi),動物也幾乎沒有自發(fā)補(bǔ)償?shù)膬A向[17]。該模型具有DA病變的可預(yù)測性、穩(wěn)定性且病變程度嚴(yán)重,因此對于評估長期藥理治療或神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)作用的研究特別有用。但是6-OHDA病變不模擬PD的多系統(tǒng)病理[27]。黎民等[28]選取不同部位注射不同劑量6-OHDA建立帕金森病大鼠模型,進(jìn)行對比分析后發(fā)現(xiàn)位于中腦黑質(zhì)致密區(qū)單點(diǎn)注射24 mg建立PD大鼠模型,操作過程相對簡便,造模成功率高,模型病理特征穩(wěn)定,且動物死亡率低,是一種可以廣泛應(yīng)用的PD大鼠模型建立方法。

1.2.1 雙側(cè)6-OHDA損毀模型

造模方法為采用200～300 g大鼠在麻醉后進(jìn)行大腦立體定位,將6-OHDA注入雙側(cè)黑質(zhì)或前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrain bundle,MFB)。由于雙側(cè)注入6-OHDA不僅可以引發(fā)動物出現(xiàn)運(yùn)動障礙癥狀,還會出現(xiàn)較為嚴(yán)重的吞咽障礙、渴感缺乏等癥狀,動物因不能進(jìn)食和飲水而出現(xiàn)死亡率極高的現(xiàn)象,相對較少采用。

1.2.2 單側(cè)6-OHDA損毀模型

動物及手術(shù)操作同雙側(cè)模型。根據(jù)注射藥物劑量和注射位點(diǎn)的不同,采用立體定位將一定量的6-OHDA注射至一側(cè)的黑質(zhì)或內(nèi)側(cè)前腦束可以建立所謂“單側(cè)”損傷的帕金森病模型,一般在注射后24 h出現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的變性,2～3 d后出現(xiàn)紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少,成功的模型發(fā)現(xiàn)其紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少了80%～90%[29]。6-OHDA單側(cè)損毀的模型是目前在研究中使用最多的動物模型之一,它可以表現(xiàn)出類似于人類帕金森病的病理特點(diǎn),如黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生、紋狀體多巴胺含量降低等,可以在同1只動物的損傷側(cè)與非損傷側(cè)進(jìn)行相互對比;另外,最突出的優(yōu)點(diǎn)就是藥物誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為檢測,是評價帕金森病干預(yù)療效的一個穩(wěn)定可靠的指標(biāo)。梅加明等[30]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)三靶點(diǎn)注射6-OHDA至紋狀體不僅能穩(wěn)定高效制備慢性PD動物模型,同時也降低了大鼠死亡率,是一種有效的PD制備模型。

1.3 魚藤酮模型

魚藤酮是一種天然化合物,常被用作殺蟲劑。它具有親脂性,能穿透血腦屏障,作用于非多巴胺神經(jīng)元,釋放細(xì)胞因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)物質(zhì),引起多巴胺神經(jīng)元凋亡或壞死;或者直接作用于多巴胺神經(jīng)元內(nèi)的線粒體,釋放ROS,干擾多巴胺代謝,最終通過氧化應(yīng)激和能量障礙,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死,從而使生物體出現(xiàn)PD樣癥狀[31]。研究者曾將極高濃度魚藤酮通過立體定向注入神經(jīng)元細(xì)胞,導(dǎo)致紋狀體多巴胺和5-羥色胺顯著減少[32],然而高劑量魚藤酮對多巴胺能神經(jīng)元沒有特異性。事實(shí)上,高濃度的魚藤酮在紋狀體區(qū)域引起了液化壞死。相反,當(dāng)長期吸入較低劑量魚藤酮時,它能夠在黑紋質(zhì)區(qū)選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞變性[33]。

原發(fā)性帕金森病的一個重要特征是黑質(zhì)區(qū)路易小體的富集,路易小體的主要組成部分是纖維狀的α-突觸核蛋白(α-synuclein),而在正常情況下,α-突觸核蛋白為細(xì)胞中非纖維化的可溶性蛋白質(zhì),因此α-突觸核蛋白的纖維化在帕金森病的發(fā)病中起重要作用[15]。研究表明,對大鼠慢性注射低劑量魚藤酮,會引起黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元的退化,而存活下來的黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中也出現(xiàn)了與路易小體極為相似的富含α-突觸核蛋白的包涵物[33]。此外,在魚藤酮動物模型中觀察到其他PD相關(guān)特征,如運(yùn)動缺陷、兒茶酚胺耗竭和黑質(zhì)多巴胺細(xì)胞丟失。它具有復(fù)制人類PD關(guān)鍵病理特征的能力,可以成為進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)研究的有價值的工具。該模型已被用于研究褪黑素在神經(jīng)保護(hù)中的作用[34]。因此,與MPTP模型相比,魚藤酮模型是研究PD病理中路易小體形成的理想模型。但是魚藤酮存在半衰期短、降解快的特點(diǎn)。隨著時間的推移,魚藤酮模型自愈性越來越明顯,因此不能很好地模擬出人類PD的慢性進(jìn)程。

1.4 百草枯模型

百草枯(paraquat,PQ)是發(fā)展中國家農(nóng)業(yè)勞動者普遍使用的一種除草劑[35]。其與MPP的結(jié)構(gòu)具有相似性,被認(rèn)為是一種神經(jīng)毒物[36],它可能是PD病因的環(huán)境因素之一。百草枯在體外和體內(nèi)均能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老和激活細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型,衰老細(xì)胞的耗竭對PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)病理有保護(hù)作用。Chinta等[37]的研究數(shù)據(jù)表明,接觸某些環(huán)境毒素會促進(jìn)大腦中衰老細(xì)胞的積累,這可能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性。全身注射百草枯會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失。百草枯會損害谷胱甘肽和硫氧還蛋白的氧化還原循環(huán),影響保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的功能[38]。然而,一項(xiàng)研究表明,長期服用百草枯會導(dǎo)致慢性神經(jīng)變性和多巴胺耗竭,可用于研究PD的臨床前階段[39]。PQ也會導(dǎo)致線粒體功能受損,這與人成纖維細(xì)胞的衰老誘導(dǎo)有關(guān)[40]。

但是,百草枯模型也存在缺陷。國內(nèi)外通常采用通過腹腔、腦內(nèi)或皮下注射百草枯的方法建立小鼠、大鼠PD模型,且每次給藥劑量大,用藥時間短。這樣的造模方式與人類的主要經(jīng)口暴露于百草枯的方式不一致。羅烘權(quán)等[41]通過口服途徑使大鼠較長時間暴露于百草枯,模擬人類接觸百草枯的方式建立PD大鼠模型,該方法也具有造模所需時間較長,不具備時效性的弊端。

2 機(jī)械、物理損毀因素制備的帕金森病動物模型

MFB是大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元傳遞到紋狀體的主要通路,同時,該通路也是紋狀體源性神經(jīng)營養(yǎng)因子營養(yǎng)黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的途徑。因此,MFB受損后會造成黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元缺乏營養(yǎng)因子而死亡。Brecknell等[42]于1995年利用線刀切斷MFB造成大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元死亡建立了機(jī)械損傷的PD模型。這種方法定位準(zhǔn)確,對其他腦區(qū)損傷小,且成功率高,實(shí)驗(yàn)成本低。同時能夠造成多巴胺神經(jīng)元漸進(jìn)性地?fù)p傷,可以模擬PD病理變化的全過程。因此,該方法被較多研究者使用,尤其是在研究如何預(yù)防PD以及神經(jīng)元再生等領(lǐng)域。但是建立該模型觀察的時間周期太長,且手術(shù)后不易把握損傷的程度。由于神經(jīng)毒素6-OHDA等模型的急性嚴(yán)重?fù)p傷特性難以表現(xiàn)出帕金森病病情的漸進(jìn)性發(fā)展趨勢。因此,建立一種能較好地模擬SNc部位多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死的動物模型極為重要。在MFB損傷第18天和第19天后分別造成44%和50%多巴胺能神經(jīng)元死亡[43]。這種機(jī)械損傷后仍有一定數(shù)量神經(jīng)元存活,為研究受損黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的再生能力提供了一種良好的動物模型。

2000年,梁希彬等[44]在國內(nèi)首次嘗試了線刀機(jī)械損傷模型,并將其應(yīng)用到電針治療帕金森實(shí)驗(yàn)中。結(jié)果顯示,MFB損傷1周后開始出現(xiàn)APO誘導(dǎo)的異常旋轉(zhuǎn)行為,且隨周齡增加其癥狀加重,甚至在造模第10周這一現(xiàn)象仍然存在。這一行為可能與多巴胺神經(jīng)元的丟失相關(guān)。MFP切斷4周后,黑質(zhì)60%的多巴胺神經(jīng)元發(fā)生進(jìn)行性死亡,紋狀體內(nèi)多巴胺含量下降了40%～60%。同時,在這種模型上可以檢測到其紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的失衡。由此可見,采用可伸縮式線刀(retractable wire knife)切斷MFB,造成大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元變性死亡方法也被廣泛使用。這種方法既定位準(zhǔn)確,又能造成多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性的損傷。

3 基因工程制備的動物模型

遺傳因素在家族性帕金森病的發(fā)病中起著決定作用,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個具有家族遺傳性的帕金森 病 致 病 基 因,如 α-synuclein、Parkin、LRRK2、PINK1及DJ-1基因等[45]。通過α-突觸核蛋白和LRKK2的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或?qū)arkin、DJ-1和PINK1等基因的敲除建立PD的遺傳模型,可研究這些基因在PD病理中的分子機(jī)制[46]。目前較多使用的轉(zhuǎn)基因動物模型是表達(dá)人α-synuclein的微包涵體,部分動物出現(xiàn)一定程度的運(yùn)動障礙[47-48]。在新近的研究中,有研究采用在星型膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)A53Tα-synuclein的轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)在此模型的中腦、腦干、脊髓中均出現(xiàn)了廣泛的炎癥反應(yīng),并伴有中腦多巴胺能神經(jīng)元的壞死和癱瘓等運(yùn)動障礙,然而這些模型很少重現(xiàn)疾病的完整特征,而且往往與人類的情況有很大的不同,大多數(shù)遺傳模型未能誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的顯著丟失[49]。Nagoshi[50]用果蠅構(gòu)建的α-synuclein轉(zhuǎn)基因PD模型具有DA神經(jīng)元丟失、路易小體形成、運(yùn)動功能退化等與人類相似的病理特征,且用果蠅建立PD模型,其繁殖速度快、遺傳規(guī)律簡單、經(jīng)濟(jì)成本低。

4 討論

帕金森病已成為既阿爾茲海默癥之后第二大危害老年人的疾病,但目前人類對其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識尚未明確,尚無有效的治療手段。人類想要認(rèn)清PD發(fā)病的機(jī)制,完全治療PD,首先要構(gòu)建出能完全與人類PD發(fā)病機(jī)制一樣的動物模型。但目前為止仍然缺乏一個能完全模擬臨床PD病理改變、發(fā)病癥狀以及病程變化的理想動物模型。目前帕金森病實(shí)驗(yàn)動物模型的種類繁多,表現(xiàn)出的帕金森病癥狀程度及病理改變各不相同,各種動物模型都有各自的優(yōu)點(diǎn)與不足,因此可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇相應(yīng)的模型。隨著帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入,相信帕金森病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕找嫱晟啤?/p>