王 巖 ， 賀 英 ， 王 煒

(1.內(nèi)蒙古大學 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020 ； 2.烏蘭察布市集寧區(qū)農(nóng)牧水利局 ， 內(nèi)蒙古 集寧 012001)

綿羊支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep，MPS)也稱為綿羊傳染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)，是由綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)引起的綿羊高度接觸性傳染病。1963年，Mackay等[1]首次在患病綿羊體內(nèi)分離到MO；1972年，Carmichael等[2]正式將此支原體命名為綿羊肺炎支原體；1979年，Livingston等[3]從患病山羊體內(nèi)同樣分離到了MO。國內(nèi)最早由胡景韶等[4]于1982年在四川發(fā)病綿羊肺臟中分離到MO，該病給我國綿羊和山羊養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

1 流行病學

MO主要感染綿羊，也可感染山羊，但綿羊比山羊的易感性更高。不同品種的羊易感性也有所區(qū)別。此外，綿羊肺炎支原體也存在于野生動物中，例如麝香牛、馴鹿和白尾鹿。MO感染可導致不同日齡羊發(fā)生肺炎，主要影響1～3月齡羔羊發(fā)生不定時性和持久性高發(fā)病率肺炎，春冬季節(jié)是該病的高發(fā)季節(jié)。

1.1 綿羊MO流行病學研究 國內(nèi)流行病學調(diào)查顯示，我國許多省市自治區(qū)均有MO的流行，江蘇、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、海南、吉林、福建、安徽、河北、山東、新疆、寧夏、青海、山西、四川等地均有MO的報道，其發(fā)病率從5%～80%不等，病死率為30%～100%[5-6]。郭晗等[7]對青海省965份綿羊血清進行檢測，不同地區(qū)綿羊陽性率范圍為19.7%～40.2%，綿羊血清平均陽性率為30.4%。李寶鈞等[8]對山西省雁北地區(qū)的12個縣隨機抽取96份血清樣本進行檢測，MO平均陽性率為38.54%。韓林梅等[9]從廣西壯族自治區(qū)6個市中采集到2 400份羊血清，經(jīng)檢測MO的個體陽性率為40.66%。吳錦艷等[5]對從我國12個省采集到3 402份血清樣本進行檢測，MO抗體平均陽性率為31.92%，其中內(nèi)蒙古自治區(qū)為高發(fā)病率地區(qū)，陽性率高達76.8%，其次是河北50%。利用綿羊肺炎支原體ELISA檢測試劑盒對新疆伊犁和巴州2個地區(qū)4個綿羊品種共計1 628份綿羊血清進行檢測，結(jié)果顯示，伊犁地區(qū)MO抗原陽性率為20.29%，抗體陽性率為16.62%；巴州地區(qū)MO抗原陽性率為14.42%，抗體陽性率為14.65%[10]。本實驗室從內(nèi)蒙古某綿羊養(yǎng)殖場發(fā)生綿羊肺炎的病羊肺臟中分離到1株羊肺炎支原體，命名為WM01株，經(jīng)生化鑒定和PCR鑒定，證實該病原體為綿羊肺炎支原體。

國際上，對伊朗一家屠宰場中肺炎攜帶羊進行檢測，綿羊支原體肺炎占比20%[11]。從日本北海道、巖手縣和青森縣采集246份綿羊血清，ELISA結(jié)果顯示，MO血清陽性率為26%[12]。在土耳其東部采集到216份患病綿羊和羔羊的肺樣品，其中57份樣本MO呈陽性，陽性率為26.4%[13]。對尼日利亞貝努埃州采集的172份綿羊鼻拭子進行檢測，共鑒定出28株MO，檢出率為16.3%[14]。針對埃及新河谷省4個私人羊群的病死羊進行檢測發(fā)現(xiàn)，病死羊肺部MO的檢出率為22.2%，MO被認為是與其他致病菌導致羊死亡率上升的罪魁禍首[15]。瑞典某家屠宰場在常規(guī)屠宰后選取44只肺部出現(xiàn)病變跡象的羔羊肺組織進行檢測，有31份樣品檢測出MO，同時溶血性曼氏桿菌的檢出率為57%[16]。2011年，美國農(nóng)業(yè)部國家動物健康監(jiān)測中心從美國22個州中選取453只家養(yǎng)綿羊進行檢測，MO的檢出率為88%。MO的存在可能使美國羊肉年產(chǎn)量減少4.3%[17]。

1.2 山羊MO流行病學研究 山羊?qū)O也極為易感，國內(nèi)學者采用間接血凝方法、ELISA方法檢測山羊血清中綿羊肺炎支原體抗體，陽性率為6.6%～88.3%；用PCR方法檢測，抗原陽性率為26.7%～73.77%。利用綿羊肺炎支原體抗體檢測正向間接血凝試劑盒對青海省208份山羊血清進行檢測，山羊血清MO陽性率范圍為6.6%～22.2%，平均陽性率為19.7%[7]。對四川省7個地區(qū)135份山羊臨床樣本進行PCR檢測，共鑒定出36株MO，MO陽性率為26.7%[18]。從海南省16個羊群中采取到1 210份血清樣本、329份鼻拭子和280份肺炎肺樣本，經(jīng)血清學檢測和PCR鑒定有383份血清樣本、24份 鼻拭子和73例肺炎肺組織樣本檢測出MO，檢出率分別為31.7%、7.3%和26.1%[19]。對福建省6個 市61份山羊疑似肺炎病料進行流行病學研究，MO陽性率為73.77%[20]。從湖南省各行政區(qū)的10家 羊場中采集到750份山羊血清，檢測結(jié)果顯示，有234份血清樣本中檢測出了MO，檢出率為31.2%，湖南省不同地區(qū)的MO陽性率范圍為22%～50%[21]。郭慧瑜等[22]從福清市采集到350份福清山羊血清，經(jīng)MO抗體酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測，MO的陽性率為88.3%。

山羊也普遍存在綿羊肺炎支原體感染。土耳其東部的44個羊群中采集的692份山羊鼻拭子，經(jīng)檢測，有56份鼻拭子檢測到MO，檢出率為8.1%[23]。從尼日利亞貝努埃州東北部、西北部和南部共采集了336份山羊鼻拭子，經(jīng)鑒定MO的陽性率為29.5%[14]。除此之外，澳大利亞、新西蘭、意大利、西班牙、蘇丹、加拿大、葡萄牙、英國、冰島等多個國家均有綿羊支原體肺炎的相關(guān)報道。MO現(xiàn)有的流行病學調(diào)查雖具有一定的局限性，但不可否認的是，MO給全球羊養(yǎng)殖業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

2 致病機理

MO通過空氣傳播，經(jīng)鼻、咽喉和氣管進入呼吸道，然后利用細胞表面結(jié)構(gòu)附著在呼吸道纖毛上皮細胞或肺泡細胞膜表面，釋放有毒代謝產(chǎn)物，造成纖毛脫落，致使部分肺小葉發(fā)生病變，隨后肺組織發(fā)生一系列病理變化，導致肺功能失調(diào)，引起漿液性纖維素性胸膜肺炎。

MO致病的分子機制還不十分清楚。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果推測，MO的致病性和體內(nèi)毒素、莢膜多糖、代謝產(chǎn)物和膜蛋白有很大的關(guān)系[24]。莢膜多糖(CPS)參與Toll樣受體(TLRs)的活化過程，在誘導炎癥反應中起重要作用，當MO被天然免疫受體TLRs識別后，激活MyD88依賴信號通路，細胞核因子κB mRNA表達水平顯著提高，促進腫瘤壞死因子TNF-α、IFN、IRF3等促炎介質(zhì)和IL-6、IL-8、IL-10等促炎因子的表達，從而引起炎癥[25]。甘油3-磷酸氧化還原酶(Glycerol 3-phosphate oxidase，Glpo)是MO致病毒力因子之一，通過參與甘油代謝途徑，生成DHAP和H2O2，而代謝產(chǎn)物H2O2則是該病的主要致病因素，CPS可能被用來加速綿羊肺炎支原體誘導的氧化應激則是通過活性氧(ROS)過表達，激活半胱天冬蛋白酶(Caspase)，Caspase-3剪切多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，啟動DNA的降解，誘導細胞凋亡，從而破壞體內(nèi)平衡[26]。

感染MO后，可抑制免疫細胞的產(chǎn)生，使總T淋巴細胞數(shù)量和B淋巴細胞亞群數(shù)量下降，免疫細胞比例失衡，最終導致機體免疫系統(tǒng)受損[27]。由于MO對免疫系統(tǒng)的破壞性作用，綿羊肺炎支原體攜帶者更容易受到其他疾病的二次感染，例如溶血性曼氏桿菌、巴氏桿菌和副流感3型病毒，從而可能導致死亡。

3 疫苗

國內(nèi)許多學者開展了支原體疫苗的研究工作，但截至到目前為止，國內(nèi)僅有1種綿羊肺炎支原體獲得新獸藥注冊證書，其他均處于實驗室研究階段。鄧光明等[28]利用地方分離株在37 ℃條件下用0.2%甲醛滅活8 h成功研制了綿羊支原體肺炎氫氧化鋁滅活苗，在免疫持續(xù)期試驗中，免疫羊群最低保護率為92.8%，免疫有限期為18個月以上。何存利等[29]利用MO標準株Y-98在37 ℃條件下用0.3%甲醛滅活48 h制備氫氧化鋁滅活苗，免疫羊群最低保護率為80%，免疫有限期9個月。李新萍等[30]利用滅活組織液和MO純培養(yǎng)物制成的綿羊支原體肺炎滅活疫苗免疫效果可達95%。韓笑等[31]利用滅活培養(yǎng)物與油佐劑1∶1混合制成滅活苗，具有良好的保護作用。胡政香[32]以MO塔城分離株S3為菌種，收菌時生長滴度為1×109CCU/mL，利用甲醛滅活48 h，20倍濃縮抗原后再將濃度稀釋為0.5 mg/mL和0.25 mg/mL，分別與油佐劑1∶1 混合乳化制備滅活苗，免疫效果良好。馮廣余[33]選用不同的油佐劑與抗原菌懸液54∶46制成滅活苗，經(jīng)驗證該疫苗安全可靠。高媛[34]利用氫氧化鋁佐劑和左旋咪唑佐劑分別制備了滅活苗，且通過對比免疫效價證明,氫氧化鋁佐劑滅活苗的效果更佳，為綿羊肺炎支原體滅活苗的制備提供了理論基礎(chǔ)。此外，在現(xiàn)有滅活苗研究基礎(chǔ)上，采用加大抗原量、新型油佐劑，更有效的滅活疫苗處理方式及根據(jù)實際情況采取不同的免疫途徑是提高疫苗保護作用切實可行的辦法。

由于綿羊肺炎支原體對培養(yǎng)條件要求高，生長周期長，使傳統(tǒng)疫苗制作成本高，發(fā)展緩慢，因此許多研究者將目光放在了基因工程疫苗的研究。天然免疫疫苗是羊用支原體疫苗研究方向之一。短腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(Short palate，lung and nasal epithelium clone 1，SPLUNC1)、肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A)、甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose-binding lectin，MBL)、殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability- increasing protein，BPI)和干擾素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15，ISG15)均是機體的天然免疫分子，對MO的感染具有抗性或抑制MO的增殖。在MO的免疫蛋白研究中，Hsp70蛋白的C-末端部分、延伸因子Tu蛋白；磷酸化蛋白質(zhì)丙酮酸脫氫酶 E1-α亞單位(Pyruvate dehydrogenase E1-α subunit，PDHA)和P128蛋白都具有良好的免疫原性。除此之外，對30S RPS11、P130、P208、P108、P109和P113等免疫原性的研究也為基因工程疫苗的研發(fā)提供了初步的理論基礎(chǔ)。為增強基因工程疫苗的免疫原性，研究者嘗試融合蛋白疫苗的研發(fā)。張亞寧[35]選擇P30外膜蛋白和細胞因子INFγ串聯(lián)融合表達，試驗制備了P30基因工程疫苗，INFγ佐劑疫苗和P30-INFγ融合蛋白疫苗，動物保護試驗、間接ELISA和Western Blot等試驗顯示，P30-INFγ融合蛋白疫苗的免疫效果要高于P30基因工程疫苗和INFγ佐劑疫苗的免疫效果。劉文青等[36-37]制備了P26、P40、P26-P40和P26-Hsp70C蛋白的基因工程疫苗，其血清效價分別為1∶8 000、1∶32 000、 1∶128 000和1∶32 000，接下來的羔羊免疫試驗進一步證實了融合蛋白疫苗的免疫效果要高于單蛋白疫苗的免疫效果，另一項試驗結(jié)果表明，P30-Hsp70C融合蛋白的免疫保護效果要高于P30蛋白的免疫保護效果。

4 防治

4.1 做好飼養(yǎng)管理 堅持“預防為主，防重于治”的原則。合理選擇廠址和科學建設(shè)羊場是預防疫病的重要措施，羊舍環(huán)境條件的好壞直接影響到動物的健康與否。在飼養(yǎng)過程中，根據(jù)不同生長階段的羊群分別提供不同飼料，科學飼養(yǎng)、營養(yǎng)全價，提高機體免疫力；放牧羊盡量減少放牧密度，采用輪牧，以便減少MO的發(fā)生，并在冬季進行適當補飼，以便營養(yǎng)充足。圈舍要定時消毒，定期驅(qū)蟲，及時清理糞便，減少病原微生物滋生和傳播的機會；強化疫病監(jiān)測，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，對于患病羊要及時隔離治療；加強動物檢疫，防止引進病羊，對新引進羔羊要進行隔離觀察和檢測。

4.2 疫苗免疫 疫苗是預防綿羊支原體肺炎的重要措施，目前已取得新獸藥證書的是由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所研制成功的可以預防山羊支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體感染的二聯(lián)苗，對綿羊支原體的預防具有一定的作用。注射該疫苗時，成年羊每只接種4 mL，小于6月齡的羊每只接種1～2 mL，免疫期半年。

4.3 藥物治療 藥物是治療MO的手段之一。慶大霉素、鏈霉素、硫酸新霉素和硫酸阿米卡星等氨基糖苷類抗生素及青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素對于支原體肺炎治療效果欠佳。鹽酸環(huán)丙沙星、乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸左旋氧氟沙星和恩諾沙星等喹諾酮類藥物及氟苯尼考、替米考星、酒石酸泰樂菌素、延胡索酸泰妙菌素、鹽酸林可霉素和鹽酸多西環(huán)素等藥物可以治療綿羊支原體肺炎。由于廣泛的使用抗生素，因此菌株對部分抗生素存在耐藥性，在一項研究中發(fā)現(xiàn)，使用延胡索酸泰妙菌素時MO分離株的最小殺菌濃度是標準株Y-98的4倍，使用鹽酸林可霉素時MO分離株的最小殺菌濃度是標準株Y-98的8～10倍，使用氟苯尼考時發(fā)現(xiàn)僅對標準株Y-98起作用，對分離株不起作用。因此在治療疾病時，要多種抗生素同時使用，避免MO對單一抗生素存在耐藥性，但用藥時要根據(jù)說明書合理用藥。中西藥結(jié)合治療支原體肺炎的效果也頗為顯著，最常用的中藥是自制“麻石杏甘湯”，具有清肺定喘的作用。

5 展望

近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和生活質(zhì)量的提高，對高品質(zhì)羊肉的需求越來越高，但由于人們對其重視程度不夠，以及檢測控制手段不完善，使綿羊支原體肺炎的發(fā)病率一直在上升。因此，一方面要提高對綿羊支原體肺炎的認識，從管理中杜絕該病的發(fā)生和蔓延；另一方面，要利用現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，加快對病原體基因功能研究的步伐，揭示其致病機理，為檢測手段的改進及藥物和新型疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。