張英楠 ， 張桂山 ， 徐 晶 , 楊樹寶,4

(1. 長春科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 ， 吉林 長春 130600 ； 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013 ； 3. 吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013 ； 4. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 吉林 長春 130118)

近年來，關(guān)于各種多糖對動物免疫調(diào)節(jié)的研究很多，但大多數(shù)只是對一些免疫指標(biāo)(如抗體效價、免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖功能等)進(jìn)行檢測，而對多糖具體通過什么途徑來影響免疫細(xì)胞及免疫分子的增殖、分化和分泌等，即多糖調(diào)控免疫活性的機(jī)制具體是什么還了解較少。但是最近幾年，隨著細(xì)胞和分子手段的不斷應(yīng)用，許多學(xué)者也對多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理進(jìn)行了探索，并得到了一些突破性的成果。目前，研究最為透徹的即為Toll樣受體/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信號通路，它的發(fā)現(xiàn)對于揭示多糖免疫機(jī)制具有重要意義[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面存在多種多糖作用受體，如 TLR2、TLR4等，多糖可以通過與這些受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，活化NF-κB，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此目前被認(rèn)為最經(jīng)典的多糖免疫調(diào)節(jié)通路為TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，一些學(xué)者也嘗試?yán)肨LR2、TLR4抗體以及NF-κB阻斷劑PDTC等阻斷此條信號通路的刺激信號傳輸[3-4]，從而研究多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

本課題組前期研究表明，刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)具有促進(jìn)免疫器官及黏膜淋巴組織發(fā)育、淋巴細(xì)胞定位分布、血液中CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞增殖功能、抗體效價、細(xì)胞因子分泌等免疫調(diào)節(jié)作用，Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2促進(jìn)血液中CD4+T淋巴細(xì)胞含量、Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-10抑制Th1類細(xì)胞活性并增加抗體產(chǎn)生等[5-6]，但是關(guān)于具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步發(fā)掘和探究。因此，本試驗結(jié)合經(jīng)典的信號通路TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，以雞血液淋巴細(xì)胞為研究對象，觀察用 TLR2 和TLR4抗體和 NF-κB阻斷劑PDTC處理雞外周血淋巴細(xì)胞后，各種細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的變化，探究可能的信號通路，從而初步揭示ASPS的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10只30日齡健康海蘭褐蛋雞，購自長春市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種雞場。

1.2 主要試劑 刺五加多糖由本實驗室提取和純化，多糖純度為 81%。肝素鈉、RPMI-1640培養(yǎng)液，均購自鼎國生物技術(shù)公司；胎牛血清，購自美國Gibco；疊氮鈉，購自北京化工；淋巴細(xì)胞分離液，購自灝洋生物制品公司；紅細(xì)胞裂解液，購自碧云天生物技術(shù)研究所；總RNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix，均購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (DRR047A)、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，均購自寶生物工程(大連)有限公司；TLR2和TLR4抗體，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PDTC，購自Sigma公司。

1.3 主要儀器 冷凍離心機(jī)5424R，Eppendorf公司；水平離心機(jī),Fastwin公司；12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國Greiner Bio-One公司；ABI StepOneTM實時熒光定量PCR儀。

1.4 方法 將分離得到的淋巴細(xì)胞懸液加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL，在不同孔中分別加入終濃度為20 μg/mL的TLR2和TLR4抗體以及10 μmol/L的PDTC，培養(yǎng)1 h，然后加入200 μL終濃度200 μg/mL ASPS進(jìn)行培養(yǎng)。另設(shè)不加任何處理的空白對照組和只加200 μg/mL ASPS的ASPS處理組。39.5 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞上清液，收集淋巴細(xì)胞，進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，并對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測。引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于實時熒光定量PCR擴(kuò)增的雞細(xì)胞因子引物Table 1 Primers used for the real-time fluorescence quantitative PCR amplification of chicken cytokines

1.5 數(shù)據(jù)分析 將得到各樣品的平均Ct值采用ΔΔCt法進(jìn)行計算分析，公式為2-ΔΔCt。各組均以12 h 空白組為樣本對照，計算其他各試驗組相對于12 h空白組的表達(dá)量倍數(shù)，試驗數(shù)據(jù)以Means±SD 表示，SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ASPS對TLR2和TLR4抗體阻斷的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響 結(jié)果如圖1A所示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-2 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，約是空白對照組的6倍左右。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理(TLR2+ASPS組)后，IL-2 mRNA表達(dá)量并未明顯下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理(TLR4+ASPS組)后，IL-2 mRNA表達(dá)量明顯下降，但下降幅度較小，仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)。

圖1B顯示，與IL-2相似，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IFN-γmRNA相對表達(dá)量顯著增加。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，IFN-γmRNA表達(dá)量并未下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IFN-γmRNA表達(dá)量明顯下降，仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細(xì)胞IFN-γmRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細(xì)胞IFN-γmRNA的表達(dá)。

圖1C顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-4 mRNA 相對表達(dá)量并未顯著增加，與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)。分別應(yīng)用TLR2 和TLR4抗體與ASPS共處理后，IL-4 mRNA表達(dá)量并無明顯變化(P>0.05)。說明TLR2和TLR4抗體對阻斷淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA的表達(dá)無影響。

圖1D顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著增加。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-10 mRNA表達(dá)量并未下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-10 mRNA表達(dá)量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)。

圖1E顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-1βmRNA相對表達(dá)量顯著增加。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-1βmRNA表達(dá)量顯著下降，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-1βmRNA表達(dá)量并未下降，與ASPS處理組相近。表明TLR2抗體能夠完全阻斷淋巴細(xì)胞IL-1βmRNA的表達(dá)，而TLR4抗體則不能阻斷淋巴細(xì)胞IL-1βmRNA的表達(dá)。

圖1F顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著增加。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-6 mRNA表達(dá)量略有下降，與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-6 mRNA表達(dá)量顯著下降，但同時仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)。

圖1G顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中iNOSmRNA相對表達(dá)量顯著增加，而且增加幅度較大，為空白對照的6倍左右。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，iNOSmRNA表達(dá)量顯著下降，介于ASPS處理組和空白對照組之間。而TLR4抗體和ASPS共處理后，iNOSmRNA表達(dá)量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體可以部分阻斷淋巴細(xì)胞iNOSmRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)。

圖1H顯示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著增加。應(yīng)用TLR2抗體和ASPS共處理后，TNF-αmRNA表達(dá)量顯著下降，但仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，TNF-αmRNA表達(dá)量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體可以部分阻斷淋巴細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)。

圖1 ASPS對TLR2和TLR4抗體阻斷的淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of ASPS on cytokines mRNA relative expression level of lymphocytes that TLR2 and TLR4 antibodies blocked肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05); 下同Different letters on the shoulder mark indicated significant difference (P<0.05),while the same letters on the shoulder mark indicated no significant difference (P>0.05). The same as below

2.2 ASPS對PDTC阻斷的外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響 結(jié)果如圖2所示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-2、IFN-γ和IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，均顯著高于空白對照組(P<0.05)，而IL-4無明顯變化。應(yīng)用PDTC和ASPS共處理后，IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)量無明顯下降，與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)，但是IL-10 mRNA表達(dá)量卻顯著下降，接近空白對照組。表明PDTC對阻斷淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA 的表達(dá)沒有作用，但可以顯著阻斷IL-10 mRNA 的表達(dá)。

圖2 ASPS對PDTC阻斷的血淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of ASPS on IL-2，IFN-γ,IL-4 and IL-10 mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

如圖3所示，ASPS處理組淋巴細(xì)胞中IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著增加，均顯著高于空白對照組(P<0.05)。應(yīng)用PDTC和ASPS共處理后，IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著下降，并接近空白對照組，IL-6也有所下降，但是與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)。表明PDTC對阻斷淋巴細(xì)胞IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表達(dá)的作用十分顯著，但并不能完全阻斷，另外對IL-6 mRNA表達(dá)的阻斷作用較小。

圖3 ASPS對PDTC阻斷的血淋巴細(xì)胞IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of ASPS on IL-1β,IL-6，iNOS and TNF-α mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

3 討論

多糖通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，其信號通路的研究存在一定的經(jīng)驗性和復(fù)制性。目前,推導(dǎo)多糖刺激淋巴細(xì)胞免疫信號通路的方法主要是通過已知受體的抗體或已知激酶的抑制劑來阻斷細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而推測該受體或激酶是否參與多糖的免疫調(diào)控過程。TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB是目前已知的最為經(jīng)典的多糖免疫調(diào)節(jié)信號通路，很多學(xué)者對不同多糖針對這一通路進(jìn)行了驗證[7-12]，并證實其普遍的適用性。因此本試驗應(yīng)用TLR2抗體、TLR4抗體和NF-κB阻斷劑PDTC分別與ASPS共處理淋巴細(xì)胞，觀察對細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的阻斷效果，從而確定各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生與此通路的關(guān)系。

本試驗發(fā)現(xiàn)，TLR2抗體能夠完全阻斷IL-1βmRNA的表達(dá)，并且PDTC也能顯著阻斷IL-1βmRNA的表達(dá)，由于IL-1β主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而且TLR2是巨噬細(xì)胞上的重要Toll樣受體，另外由于PDTC也能顯著阻斷IL-1βmRNA的表達(dá)，因此ASPS對巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生IL-1β的機(jī)制可能為：ASPS可以與巨噬細(xì)胞上的TLR2受體結(jié)合，經(jīng)TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB通路活化NF-κB，調(diào)控IL-1β在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這與Lee等[13]關(guān)于柿子多糖免疫調(diào)節(jié)信號通路、Li等[14]關(guān)于光滑環(huán)銹傘多糖對骨髓源樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)通路、Sun等[15]對獼猴桃多糖對巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的信號通路等的研究結(jié)果相一致。

本試驗同時發(fā)現(xiàn)，TLR4抗體可以完全阻斷IL-10、iNOS和TNF-αmRNA的表達(dá)，而且PDTC對阻斷淋巴細(xì)胞IL-10、iNOS和TNF-αmRNA表達(dá)的作用也十分顯著，由于IL-10主要由Th2細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而TLR4只能表達(dá)在B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等髓樣細(xì)胞上，而Th2細(xì)胞并不表達(dá)，因此可以推斷體外培養(yǎng)24 h的淋巴細(xì)胞在ASPS作用下所表達(dá)的IL-10 mRNA應(yīng)該都是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而Th2細(xì)胞要產(chǎn)生IL-10時間應(yīng)該再滯后。本試驗還發(fā)現(xiàn)，TLR2抗體也能夠部分阻斷iNOS和TNF-αmRNA 的表達(dá)，iNOS和TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，因此可以證明ASPS可以與巨噬細(xì)胞上的TLR2和TLR4受體結(jié)合，但更傾向與TLR4受體結(jié)合，從而促進(jìn)其表達(dá)IL-10、iNOS和TNF-αmRNA，其可能的信號通路為主要為TLR4→TRAF6→IKKc→ NF-κB，TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB也有一定作用，另外這與韓杰等[16]關(guān)于刺五加多糖對斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞信號傳導(dǎo)影響的研究結(jié)果一致。

TLR4抗體可以部分阻斷ASPS促進(jìn)IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)，而TLR2抗體和PDTC對IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)均沒有影響。由于IL-2和IFN-γ主要由Th1類細(xì)胞產(chǎn)生，而且Th1類細(xì)胞可以在巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-1β等的刺激下增殖分化，產(chǎn)生更多的IL-2和IFN-γ，而且TLR4主要存在于巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞，因此IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)應(yīng)該與TLR4→TRAF6→IKKc→NF-κB 信號通路無關(guān)，對于TLR4抗體可以部分阻斷ASPS促進(jìn)IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)，可能原因是：TLR4抗體使IL-1β等巨噬細(xì)胞分泌因子減少，因而Th1類細(xì)胞缺少了一部分刺激，從而導(dǎo)致IL-2和IFN-γmRNA下降。但是對于ASPS促進(jìn)IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)具體與什么通路直接相關(guān)還有待于以后繼續(xù)研究。

細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路錯綜復(fù)雜，多糖在進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)時涉及多條通路，而且各通路之間可能存在相互作用，另外多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖分子的結(jié)合受體較多，要完全闡明多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制依然是任重而道遠(yuǎn)，本試驗結(jié)合ASPS對雞的各種免疫調(diào)節(jié)作用，通過對TLR2/4→TRAF6→ IKKc→NF-κB通路的追蹤，初步對免疫機(jī)制進(jìn)行探索性的研究，以后還要對ASPS對免疫調(diào)節(jié)機(jī)制更進(jìn)一步研究。