黨慧敏，鄭平安，趙文浩，王 斌

(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海力生生物科技股份有限公司，浙江舟山 316022)

南極磷蝦Euphausia superba 生物量可達(dá)(6.5～10)×108t，是世界上最大的生物資源之一[1-3]。研究表明南極磷蝦富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和功能分子，其脂質(zhì)含量約為2.11%，主要是不飽和脂肪酸，易于人體吸收，能夠預(yù)防老年癡呆、降壓、降脂、預(yù)防冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫力和降低心血管疾病發(fā)病率[4];蛋白質(zhì)含量超過(guò)60%，含人體所需的8 種必需氨基酸，生物效價(jià)遠(yuǎn)高于肉類蛋白質(zhì)和牛乳蛋白質(zhì)[5-7]；南極磷蝦的甲殼中含有的蝦青素能預(yù)防腎病、糖尿病、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，甚至起到減肥的功效[8]；此外，南極磷蝦富含維生素A、維生素E、鈣、鎂、鋅、磷、碘、鐵和硒等[9]。因此，南極磷蝦具有可觀的經(jīng)濟(jì)和研究?jī)r(jià)值。

肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間以肽鍵將氨基酸鏈接形成的一類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、消除疲勞、抗菌、抗高血壓和抗炎等生物活性，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等較多的領(lǐng)域具有廣闊市場(chǎng)前景[10-12]。海洋生物長(zhǎng)期生活在高鹽、高壓、低溫、缺氧等極端環(huán)境中，其蛋白質(zhì)的氨基酸組成或序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列[13]。因此，以海洋生物蛋白資源為原料，利用酶工程技術(shù)開發(fā)天然、高效、新穎的海洋蛋白酶解物或者活性肽成為研究焦點(diǎn)[13-15]。例如：李亞會(huì)等[16]利用動(dòng)物蛋白水解酶和風(fēng)味酶水解擬沙丁魚Sardinops sagax 蛋白，利用超濾獲得的抗氧化肽，可調(diào)節(jié)細(xì)胞中失衡的抗氧化體系，顯示良好的保護(hù)作用。鄧志程等[13]利用酶解、超濾和色譜技術(shù)制備馬氏珠母貝Pinctada martensii 免疫活性肽AR/PM 和VR，可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖與提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。張?jiān)猍17]采用超濾膜法分離南極磷蝦多肽，MW≤5 ku 的多肽超氧陰離子、羥自由基和DPPH 自由基的清除能力最佳，并對(duì)小鼠模型表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

南極磷蝦是重要的蛋白資源，以其為原料制備蛋白酶解物或者活性肽也備受關(guān)注。ZHAO Yuqin,et al[18]從南極磷蝦胰蛋白酶酶解物中制備了8 個(gè)ACE 抑制寡肽，其中Phe-Ala-Ser (FAS) 可促進(jìn)HUVEC 細(xì)胞中內(nèi)源性舒張因子(NO)的釋放，抑制內(nèi)皮素(ET-1)的生成。XIA Guanghua,et al[21]證明磷酸化的南極磷蝦多肽可以顯著的阻止去卵巢大鼠骨質(zhì)量的降低，改善松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)特性。HOU Hu,et al[20]發(fā)現(xiàn)南極磷蝦寡肽VLGYIQIR 可以作為一種新型的鈣補(bǔ)充劑?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以自由基清除率為指標(biāo)，篩選制備南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物(EPAH)的最適酶種，并對(duì)其氨基酸組成和抗氧化活性進(jìn)行綜合分析，為南極磷蝦資源的高值化利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦蝦粉(脫脂)由浙江海力生生物科技股份有限公司提供。張氏肝細(xì)胞(Chang liver)購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。活性氧(ROS)測(cè)試盒購(gòu)買于南京建成生物工程有限公司。胰蛋白酶(200 000 U·g-1)、堿性蛋白酶(160 000 U·g-1)、胃蛋白酶(500 000 U·g-1)、中性蛋白酶(50 000 U·g-1)和風(fēng)味蛋白酶(300 000 U·g-1)購(gòu)買于上海源聚生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶種類篩選

將南極磷蝦蝦粉(脫脂)按照料液比1:20 加入到酶解溶液中，攪拌均勻。選用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，在其最佳酶解條件下(表1)進(jìn)行酶解。雙酶體系(胃蛋白酶+胰蛋白酶)制備EPAH 時(shí)，溶液pH 首先調(diào)至2.0，加入1.0%胃蛋白酶，于37 ℃酶解2 h；然后將溶液pH 調(diào)至8.0，加入1.0%胰蛋白酶，于37 ℃酶解2 h。酶解液于沸水浴滅酶10 min，以4 000 r·min-1的條件下離心15 min，舍棄下層沉淀，上清液冷凍干燥得南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物(EPAH)，以DPPH 自由基(DPPH·)和羥基自由基(HO·)清除率為指標(biāo)評(píng)價(jià)EPAH，篩選最適酶種及其組合。

表1 5 種蛋白酶的酶活力及最適溫度和pHTab.1 The enzyme activity,optimum temperature and pH of the five enzymes

1.2.2 自由基清除和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)

DPPH·和HO·清除率實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[21-22]描述的方法進(jìn)行。脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[23-24]描述的方法進(jìn)行。

1.2.3 氨基酸組成成分分析

參照GB 5009.124-2016 使用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。按照聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO) 1973 年建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式[25]和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提出的雞蛋蛋白質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行比較分析，包括：氨基酸評(píng)分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)[26]。

1.2.4 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 氧化損傷模型的建立

將張氏肝細(xì)胞按照1.5×105個(gè)/孔接種于4 個(gè)96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中孵育24 h后，繼續(xù)將每個(gè)96 孔板分為空白對(duì)照組和8 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，空白組加入20 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基，8 個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入20 μL 的雙氧水(H2O2)使其終濃度分別為100、200、300、400、500、600、700 和800 μmol·L-1，平行6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h 后，加入20 μL 5 mg·mL-1的噻唑藍(lán)(MTT)溶液，培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)液體倒置在吸水紙上吸干，每孔再加入150 μL 的二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃避光震蕩15 min，于570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光值(OD)。細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算：

式中：CSR 為細(xì)胞存活率，%；OD實(shí)驗(yàn)組為實(shí)驗(yàn)組吸光值；OD空白對(duì)照組為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.4.2 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞細(xì)胞給藥濃度的篩選

將制好的細(xì)胞懸液接種于96 孔板。待細(xì)胞貼壁后加雙氧水處理12 h，建立張氏肝細(xì)胞氧化損傷模型。同時(shí)將細(xì)胞分為空白組、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1EPAH 給藥組培養(yǎng)24 h，通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPAH 對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

1.2.4.3 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞細(xì)胞存活率的測(cè)定

將張氏肝細(xì)胞接種于96 孔板，建模后將細(xì)胞分為空白組、模型組、EPAH 組和GSH 組，以最佳濃度的EPAH (15 mg·mL-1)干預(yù)24 h，再檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.4.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測(cè)定

細(xì)胞前處理方法同1.2.3.1，在加入20 μL 雙氧水(H2O2)的同時(shí)加入10 μmol·L-1的熒光染料2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，并在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2 次。通過(guò)熒光顯微鏡(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm/535 nm)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶種類的篩選

蛋白酶的種類顯著影響蛋白酶解物的分子量及其活性[2,24]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)南極磷蝦蝦粉進(jìn)行酶解，并比較5 種EPAH 的自由基清除活性。

圖1A 結(jié)果表明：在15.0 mg·mL-1的樣品濃度下，胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的DPPH·清除率分別為44.09%±1.04%和46.7%±2.39%，顯著高于中性蛋白酶(35.28%±2.33%)、風(fēng)味蛋白酶(32.54%±1.86%)、堿性蛋白酶(41.12%±1.2%)EPAH 的DPPH·清除率(P＜0.05)，且胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的DPPH·清除率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。圖1B 結(jié)果表明：在15 mg·mL-1的樣品濃度下，胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的HO·清除率分別為35.76%±1.58%和33.03%±1.71%，顯著高于中性蛋白酶(29.39%±1.57%)、風(fēng)味蛋白酶(23.53%±1.35%)、堿性蛋白酶(28.13%±2.36%)EPAH 的HO·清除率(P＜0.05)，且胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的HO·清除率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 5 種南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的DPPH 自由基(A)和羥基自由基(B)清除活性Fig.1 DPPH radical (A) and hydroxide radical (B) scavenging rate of five antioxidant hydrolysates of E.superba protein

圖2 結(jié)果表明：在15 mg·mL-1的樣品濃度下，雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備的EPAH 的DPPH·和HO·清除率分別為55.49%±3.05%和48.94%±1.11%，顯著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶制備的EPAH (P＞0.05)。因此，選取雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備EPAH。

圖2 胰蛋白酶、胃蛋白酶和雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的DPPH 自由基(A)和羥基自由基(B)清除率Fig.2 DPPH radical (A) and hydroxide radical (B) scavenging rates of antioxidant hydrolysates of E.superba protein using pepsin,trypsin,and double enzyme system (pepsin+trypsin),respectively

2.2 南極磷蝦蛋白水解物(EPAH)的氨基酸組成分析

EPAH 氨基酸組成如表2 所示。測(cè)定17 種氨基酸，其中包括Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe 和Lys 7 種必需基酸，His 和Arg 2 種半必需氨基酸，Gly、Ala、Pro、Asp、Ser、Cys、Glu 和Tyr 8 種非必需氨基酸，總氨基酸(WTAA)含量為62.72%±0.42%，必需基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸分別占總氨基酸含量的26.17%±0.16%、5.64%±0.03%和30.91%±0.24%。

表2 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸組成分析(,n=3)Tab.2 The contents of amino acids in protein hydrolysate of E.superba

表2 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸組成分析(,n=3)Tab.2 The contents of amino acids in protein hydrolysate of E.superba

注:* 鮮味氨基酸；** 必須氨基酸.

南極磷蝦蛋白水解物必需氨基酸的AAS、CS和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)計(jì)算結(jié)果(表3)顯示：AAS 第一限制性氨基酸為纈氨酸(Val)，評(píng)分為0.75，其次是蘇氨酸(Thr)，評(píng)分為0.76；苯丙氨酸+酪氨酸(Phe+Tyr)評(píng)分最高，AAS為1.04，其次為賴氨酸(Lys)，AAS 為1.09。在CS中，賴氨酸(Lys)的化學(xué)評(píng)分最高，為0.75，其次是蘇氨酸(Thr)，為0.65，最低的是甲硫氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)，CS為0.50，其次為纈氨酸(Val)，CS 為0.57。金槍魚魚卵必需氨基酸指數(shù)EAAI 值為63.02。必需氨基酸/氨基酸總量(WEAA/WTAA)的值為40.73%，WEAA/WNEAA 的值為84.67%。

表3 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸評(píng)分(AAS)和化學(xué)評(píng)分(CS)Tab.3 Amino acids scores (AAS) and chemical score(CS) in protein hydrolysate of E.superba

2.3 南極磷蝦蛋白水解物脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性

抗氧化物結(jié)構(gòu)的不同，對(duì)自由基清除的機(jī)制和能力有所差異。因此，常采用脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)估蛋白水解物的抗氧化能力[18,24]。以谷胱甘肽(GSH)為陽(yáng)性對(duì)照物，將濃度為15.0 mg·mL-1的EPAH 加入到實(shí)驗(yàn)體系中，每天記錄500 nm 吸光值?；衔锏目寡趸芰υ綇?qiáng)，其對(duì)亞油酸氧化的抑制作用就越大，500 nm 吸光值上升緩慢。

圖3 結(jié)果表明：空白對(duì)照組500 nm 吸光值變化最大，在7 d 時(shí)間里迅速上升，表明亞油酸的氧化程度最高；谷胱甘肽(GSH)組500 nm 吸光值變化最小，說(shuō)明GSH 具有最強(qiáng)的抗氧化能力，很好地抑制了亞油酸的氧化變質(zhì)；EPAH 組500 nm 吸光值顯著低于空白對(duì)照組，說(shuō)明其可以較好地抑制系統(tǒng)中亞油酸的過(guò)度氧化。因此，南極磷蝦蛋白水解物具有明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力，但活性低于GSH。

圖3 南極磷蝦蛋白水解物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力Fig.3 Lipid peroxidation inhibition assays of protein hydrolysate of E.superba

2.4 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞的保護(hù)作用

2.4.1 張氏肝細(xì)胞氧化損傷模型的建立

以MTT 檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)張氏肝細(xì)胞存活率的影響，細(xì)胞存活率在50%左右為建模最佳濃度[27]。圖4 結(jié)果表明：雙氧水(H2O2)濃度對(duì)張氏肝細(xì)胞存活率有顯著性的影響(P＜0.05)，隨著雙氧水濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著下降，在300 μmol·L-1濃度下，細(xì)胞存活率為47.61%±3.92%。因此，選擇濃度為300 μmol·L-1的H2O2建立張氏肝細(xì)胞氧化損傷模型。

圖4 雙氧水濃度對(duì)張氏肝細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of H2O2 concentration on viability of Chang liver cells

2.4.2 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響

圖5A 結(jié)果表明：EPAH 作用張氏肝細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率均保持在90%以上，與空白組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。說(shuō)明EPAH 在0～30 mg·mL-1濃度下對(duì)張氏肝細(xì)胞的增殖沒有顯著的抑制作用。圖5B 結(jié)果表明：在15 mg·mL-1濃度下，EPAH 將張氏肝細(xì)胞的存活率提高到57.98%±2.57%，顯著高于模型組(47.61%±3.92%) (P＜0.01)，但其活性略低于陽(yáng)性對(duì)照GSH。因此，EPAH 可以顯著降低H2O2對(duì)張氏肝細(xì)胞的氧化損傷。

圖5 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)張氏肝細(xì)胞(A)和氧化損傷張氏肝細(xì)胞(B)存活率的影響Fig.5 Effects of protein hydrolysate of E.superba on viability of Chang liver cells (A) and H2O2 damaged Chang liver cells (B)

2.4.3 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞活性氧(ROS)水平的影響

圖6 結(jié)果表明：模型組較對(duì)照組張氏肝細(xì)胞中ROS 水平顯著性升高(P＜0.001)，說(shuō)明所建氧化損傷模型可用。與模型組相比，15 mg·mL-1濃度的EPAH 可以顯著降低H2O2損傷的張氏肝細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平(P＜0.01)，降低H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。

圖6 南極磷蝦蛋白水解物對(duì)氧化損傷張氏肝細(xì)胞活性氧水平的影響Fig.6 Effects of protein hydrolysate of E.superba on level of reactive oxygen species of H2O2 damaged Chang liver cells

3 結(jié)論

南極磷蝦是目前儲(chǔ)量最豐富的海洋優(yōu)質(zhì)蛋白資源，其高值化開發(fā)利用備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以DPPH·和HO·清除率為導(dǎo)向，篩選出雙酶體系(胰蛋白酶和胃蛋白酶)制備南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物。制備的南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物富含必需基酸和半必需氨基酸，必需氨基酸指數(shù)(EAAI)為63.02，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外，南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物具有顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用。用南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物配成一定濃度的溶液，建立細(xì)胞氧化損傷模型，測(cè)定ROS 水平變化情況，以此為指標(biāo)來(lái)衡量南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的抗氧化活性強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，15 mg·mL-1的酶解物抗氧化活性較好。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步進(jìn)行南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物抗氧化活性機(jī)制研究提供了一定的參考價(jià)值，可通過(guò)測(cè)定南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的氨基酸序列來(lái)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備的南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物為抗氧化功能產(chǎn)品的研發(fā)提供了一定的方向。