劉孟楠，羅 鋼，劉 平，劉佳利，劉 顏，周 華，楊思進(jìn)△

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州646000；2 澳門(mén)科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）危害巨大，是誘發(fā)冠心病、心肌梗死、腦梗死等疾病的主要原因［1］。血脂代謝紊亂與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、流行病學(xué)研究及臨床試驗(yàn)中已達(dá)到共識(shí)［1］。近年來(lái)研究報(bào)道膽固醇結(jié)晶可作為內(nèi)源性信號(hào)分子激活NLRP3 炎癥小體，促進(jìn)炎癥因子的成熟與分泌，介導(dǎo)AS早期炎癥反應(yīng)［2］，而核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)磷酸化與NLRP3炎癥小體的激活關(guān)系密切，通過(guò)活化NFκB模式識(shí)別受體或細(xì)胞因子受體可啟動(dòng)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［3］，表明p-NF-κB、NLRP3炎癥小體參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。

目前對(duì)于AS 及血脂紊亂的治療重點(diǎn)在于改善低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），隨著他汀類藥物的廣泛應(yīng)用，血脂的調(diào)理更為科學(xué)有效，但AS 的危險(xiǎn)性仍然存在［4］。針對(duì)AS誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，楊思進(jìn)教授研發(fā)蛭龍活血通瘀膠囊“補(bǔ)氣通絡(luò)，活血化瘀，化痰祛風(fēng)”，治療AS 類疾病中取得了較好效果，為補(bǔ)氣、活血、祛風(fēng)、化痰類中成藥改善血脂代謝及防治AS提供了策略［5］。本研究旨在探討蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔血脂的影響及該藥物改善頸動(dòng)脈病變組織p-NF-κB及NLRP3的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)新西蘭大白兔40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.4）kg，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（川）2018-065。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，光照每日12 h，室溫19～22℃，濕度40～60%飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥品與試劑基礎(chǔ)飼料由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料配方（以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：96%的普通飼料、2%的膽固醇、2%的豬油。蛭龍活血通瘀膠囊（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室提供，批準(zhǔn)文號(hào)：川藥字Z20070528，規(guī)格：0.4 g×48 粒/瓶）；阿托伐他?。ū本┘瘟炙帢I(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093819，規(guī)格：20 mg×7片/盒）；麗春紅、吐溫20、丙烯酰胺及BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Tris-Hcl、NaCl 購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；0.45 μm PVDF 膜（Millipore，Schwalbach，Germany）、anti-p-NF-κB（貨號(hào)：stj28018）購(gòu)自英國(guó)St John′s Laboratory；anti-NF-κB（貨 號(hào)：arp38197_p050）、anti-NLRP3 antibody（貨號(hào)：arp63297_p050）購(gòu)自美國(guó)Aviva Systems Biology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器BS224 型電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；78-1 型磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；3K15 型低溫高速離心機(jī)（Sigma公司）；冷凍離心機(jī)（HettichMikro 200R）；Berthold LB941微孔板式多功能酶標(biāo)儀（Berthold公司）；MINI-PTET 型Western blotting 系統(tǒng)型號(hào)；COMP SYS；10 W；1.0 MM、POWERPAC HC POWER SUPPLY、SEMI DRY BLOT APPARATUS（Bio-Rad 公司）；Tanon 6600發(fā)光成像工作站（Tanon公司）。

1.4 造模方法參考武曉玲等［6］報(bào)道的使用高脂飼料加空氣干燥術(shù)建立頸動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，不禁水，經(jīng)麻醉、頸部脫毛清潔消毒后，作頸部正中切皮，于甲狀軟骨上方水平分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)約2.5 cm。血管兩端以動(dòng)脈夾阻斷血流，使用4.5 號(hào)頭皮針于血管縱軸方向穿刺進(jìn)入阻斷血管兩端，用生理鹽水沖洗置換出管腔內(nèi)血液，接流量為250 mL/min 的氣流干燥內(nèi)皮5 min，然后將夾閉的頸動(dòng)脈內(nèi)重新充滿生理鹽水并取下動(dòng)脈夾使頸動(dòng)脈恢復(fù)血供。濕潤(rùn)棉片輕輕壓迫穿刺點(diǎn)2～3 min止血?？p合皮膚創(chuàng)口并包扎。術(shù)后肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型。

1.5 分組給藥方法家兔用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組、蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組。除正常組繼續(xù)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組均高脂飼料喂養(yǎng)外，手術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周。單籠喂飼，飲水不限，每日每只進(jìn)食150 g 飼料。蛭龍活血通瘀膠囊成人用量每日4.8 g，體質(zhì)量按60 kg 計(jì)算，換算為動(dòng)物高劑量為含生藥3.12 g/（kg·d），為成人用量6 倍。阿托伐他汀組0.51 mg/（kg·d），為臨床成人用量3 倍。灌胃體積均為4 mL/kg［7］。

1.6 樣品采集與血脂測(cè)定第4 周末動(dòng)物禁食不禁水12 h，采用空氣注射法處死家兔，股動(dòng)脈采血。血樣室溫自然凝固，4℃、離心半徑8 cm，3000 r/min 離心10 min，分離血清。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）以及LDL-C 水平；沿前期頸部造模處位置做一正中切口，暴露頸總動(dòng)脈，分離動(dòng)脈鞘及周邊組織，截取造模處頸動(dòng)脈組織約2 cm備用。

1.7 頸動(dòng)脈組織總蛋白提取和免疫印跡分析稱取頸動(dòng)脈組織約50 mg，用干凈的剪刀將組織塊剪碎；加400μL RIPA 裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿，離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清，BCA 定量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。然后將膜置于封閉袋中，加入適量適當(dāng)濃度的二抗，封閉袋口，室溫下孵育1 h。剪開(kāi)自封袋，用TBST洗膜3次，每次10 min。等體積混合化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液，將膜蛋白面向下與此混合液充分接觸；5 min 后用Tanon 6600 發(fā)光成像工作站進(jìn)行檢測(cè)，并使用Image Pro Plus 6.0 軟件分析光密度值，檢測(cè)p-NF-κB、NF-κB、NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.8 HE 染色分離1 cm 長(zhǎng)的頸動(dòng)脈組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm 石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水，切片入蘇木素染液染后，沖洗分化反藍(lán)，經(jīng)伊紅染色后脫水封片。400 倍光鏡下觀察組織情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況家兔一般狀況良好，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組家兔未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物等副作用表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。各組家兔體質(zhì)量呈生理性增長(zhǎng)，在第0、2、4 周組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組家兔不同時(shí)間體質(zhì)量比較（±s） kg

表1 各組家兔不同時(shí)間體質(zhì)量比較（±s） kg

2.2 血脂水平與正常組比較，模型組TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平均升高（P＜0.01），提示高脂血癥模型造模成功；各用藥組HDL-C 均有所升高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組TC、TG、LDL-C 水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各給藥組TC、TG 水平下降（P＜0.01），阿托伐他汀組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組LDL-C降低（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊可一定程度上降低LDL-C，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與阿托伐他汀組相比，蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組降低TC的效果更明顯（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀降低LDL-C 的作用較阿托伐他汀組更強(qiáng)（P＜0.05）；各給藥組及模型組間HDL-C 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

注：與正常組比較，##表示P＜0.01；與模型組比較，**表示P＜0.01；*表示P＜0.05；與阿托伐他汀組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05

2.3 頸動(dòng)脈組織p-NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)與模型組相比，蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組p-NF-κB、NLRP3水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組比較，蛭龍活血通瘀膠囊組p-NF-κB、NLRP3 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），阿托伐他汀組p-NF-κB 水平高于蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 頸動(dòng)脈組織p-NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)

2.4 頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變藥物干預(yù)4 周后，光鏡下正常組家兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮完整，分界較清晰，內(nèi)膜光滑，平滑肌細(xì)胞完整，排列整齊；模型組頸動(dòng)脈內(nèi)大量脂質(zhì)沉積并有向管腔內(nèi)凸起的斑塊，中膜內(nèi)層出現(xiàn)斷裂，平滑肌細(xì)胞顯著增生，可見(jiàn)由大量泡沫細(xì)胞構(gòu)成的脂質(zhì)斑塊，斑塊內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并有變性壞死；治療后蛭龍活血通瘀膠囊組，阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組炎癥細(xì)胞減少，內(nèi)皮細(xì)胞增生腫脹并有脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞腫大增生、排列紊亂頸動(dòng)脈內(nèi)膜有粥樣斑塊沉積，其中蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組內(nèi)皮細(xì)胞下有脂質(zhì)沉積，其形態(tài)學(xué)變化接近于正常組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組家兔頸動(dòng)脈病理變化（HE，×400）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔TC、TG，降低頸動(dòng)脈病變組織NF-κB 的磷酸化及NLRP3 蛋白的表達(dá)。蛭龍活血通瘀膠囊是楊思進(jìn)教授在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、桂枝、大血藤、水蛭、地龍等藥組成。該中藥復(fù)方制劑在治療腦卒中、冠心病、血栓性疾病等方面臨床反饋較好［5-7］。在蛭龍活血通瘀膠囊的前期研究中吳英等［8］證實(shí)該藥物可降低高脂血癥大鼠血脂水平。楊思進(jìn)等［9］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蛭龍活血通瘀膠囊可以降低家兔預(yù)動(dòng)脈NF-κB、ICAM-1 表達(dá)，改善高血壓頸動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔頸動(dòng)脈AS 病變。前期研究與本研究結(jié)果一致，表明蛭龍活血通瘀膠囊抗AS作用確切。

高脂血癥被認(rèn)為是AS 發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)認(rèn)為基于脂質(zhì)沉積而形成的斑塊是由于血液中脂質(zhì)水平過(guò)高從而滲透至血管內(nèi)膜造成，且有研究報(bào)道AS 的發(fā)生與TC 升高呈正相關(guān)［4］。AS 形成需要NLRP3 炎性小體的活化參與，膽固醇晶體通過(guò)激活NLRP3 炎性小體，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙誘導(dǎo)AS 的發(fā)生［10-11］。NLRP3 炎癥小體的活化需要啟動(dòng)和激活雙重信號(hào)調(diào)控，NF-κB 介導(dǎo)了啟動(dòng)過(guò)程，磷酸化的NF-κB可上調(diào)NLRP3等相關(guān)炎性因子前體表達(dá)，因此p-NF-κB 為NLRP3 活化提供物質(zhì)基礎(chǔ)［12］。通過(guò)抑制p-NF-κB 降低NLRP3 及相關(guān)炎性因子前體的表達(dá)從而抑制NLRP3炎癥小體的激活［13-14］。

本研究采用高脂飼料加空氣干燥術(shù)建立頸動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型［9］。該造模方法成熟，成功率高，易于復(fù)制，可在較短時(shí)間誘發(fā)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化并形成斑塊。阿托伐他汀是目前臨床常用的降血脂藥物，故本實(shí)驗(yàn)將其選為對(duì)照藥物［15-16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔TC、TG，抑制頸動(dòng)脈病變組織p-NF-κB、NLRP3 表達(dá)，可以通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗血栓及對(duì)抗脂質(zhì)浸潤(rùn)的作用來(lái)抑制高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型頸動(dòng)脈斑塊的形成，且蛭龍活血通瘀膠囊與阿托伐他汀聯(lián)合可提高療效。因此，蛭龍活血通瘀膠囊發(fā)揮抗AS 的作用機(jī)制可能是通過(guò)改善血脂、抑制NF-κB 的磷酸化及NLRP3 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，但其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。