陳震，苗馨，孔明慧，何夢凡，張俊麗，代亞峰

(信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

隨著科技的進步和社會的發(fā)展，人們對食品開發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注越來越多。以前，人們往往只注重于食物的數(shù)量，時過境遷，現(xiàn)在的人們更加重視食品的感官、味道、營養(yǎng)與安全。因此，目前有很多的食品都使用了大量的添加劑，而這些添加劑的來源及安全性成為了人們關(guān)注的重點?，F(xiàn)在的消費者們也更加注重健康的飲食習(xí)慣，追求天然的食品成分，但是僅僅依靠天然萃取獲得的食品添加劑遠遠不夠人們所食用。當下，有一種技術(shù)可以生成與天然萃取一樣健康的成分，這就是發(fā)酵工程技術(shù)。盡管許多人知道發(fā)酵可以生產(chǎn)醋、豆瓣醬、啤酒、奶酪及味精等傳統(tǒng)產(chǎn)品，但很少有人知道它還可以創(chuàng)造出其他新的食品成分?，F(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)與傳統(tǒng)發(fā)酵不完全相同，現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)者不向發(fā)酵材料中直接接種起始生物，而是將目標基因直接插入宿主生物中，然后利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)目標生物并生產(chǎn)副產(chǎn)品成分，生產(chǎn)者可以從發(fā)酵物中提取目的成分并純化以供使用。發(fā)酵工程技術(shù)運用于食品開發(fā)領(lǐng)域，可以充分發(fā)揮出發(fā)酵工程的魅力，不僅豐富了發(fā)酵產(chǎn)品的種類，而且提升了食物的口感與品質(zhì)，減少了食品添加劑的制作難度，更能夠消除人們對食品添加劑的恐慌。隨著科技的持續(xù)發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)在食品添加劑領(lǐng)域一定會大有作為。本文介紹了幾種常見的食品添加劑，并逐一介紹了發(fā)酵工程技術(shù)在其中的創(chuàng)新性應(yīng)用，為今后利用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)新型食品添加劑的研究提供了參考。

1 著色劑

能夠使物質(zhì)顯現(xiàn)出設(shè)計所需要的顏色的物質(zhì)被統(tǒng)稱為著色劑。在食品行業(yè)，著色劑又經(jīng)常被叫作食用色素，常被用來給食物染色，改善食品的色澤，使得食物的外表顏色更加符合人們的需求。通常情況下食用色素分為兩大類：天然色素和人工合成色素[1]。

大豆血紅蛋白是一種存在于豆科植物根瘤中類似哺乳動物血紅蛋白的一種紅色色素，它原本是根瘤中類菌體呼吸作用和固氮作用的協(xié)調(diào)劑。血紅蛋白是血液中攜帶氧氣的分子，用于氧氣運輸呼吸和其他代謝功能，在我們所食用的食物如家禽、肉、魚制品由大都有血紅蛋白的存在，肉類中的血紅蛋白賦予了肉類獨特的口感，因此血紅蛋白可用于肉制品的加工[2]。為了滿足全球?qū)θ忸惖男枨笠约皽p少對環(huán)境的影響，Impossible Foods將大豆血紅蛋白這種植物來源的“血紅素”用于人造肉的染色，使人造肉的外觀、口感接近真正的肉類。2019年，美國食品藥品管理局已批準大豆血紅蛋白作為碎牛肉類似產(chǎn)品的色素添加劑。

固氮植物(例如大豆或豆科植物)會自然產(chǎn)生血紅素并將其存儲于根部，從這里可以提取一定的大豆血紅蛋白，但是其成本會變得非常高，而且也會造成環(huán)境的破壞。目前，已經(jīng)實現(xiàn)了大豆血紅蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)，通過發(fā)酵生產(chǎn)的大豆血紅蛋白可以使人造肉變紅，并讓其口感更加接近真實的肉。Jin Y等[3]通過基因工程和發(fā)酵酵母生產(chǎn)天然存在于植物中的血紅素蛋白，他們將大豆植物中編碼合成大豆血紅蛋白的LegHb基因插入酵母宿主菌Pichiapastoris(現(xiàn)在重新分類為Komagataellaphaffii)進行表達，然后通過酵母細胞發(fā)酵產(chǎn)生大豆血紅素。實驗結(jié)果表明，純化得到的畢赤酵母菌株中表達的LegHb 蛋白質(zhì)純度大于65%，以這種方式生產(chǎn)的大豆血紅蛋白已經(jīng)在基于植物的肉制品中進行了測試，濃度高達0.8%。安全測試結(jié)果表明，添加畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的重組大豆血紅素的食品不太可能對消費者產(chǎn)生不可接受的過敏性或毒性風(fēng)險。通過微生物發(fā)酵法獲得的大豆血紅蛋白，未來將在人造肉及其他食品領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

2 甜味劑

能夠賦予食品甜味的食品添加劑通常被稱為甜味劑。 甜味劑通常具備以下幾特點：引起的味覺良好、安全性高、穩(wěn)定性好、水溶性好、價格合理。甜味劑在很多食品中均有一定的應(yīng)用，比如：增強食物的甜度、使食物形成一定的風(fēng)味，對風(fēng)味的調(diào)節(jié)和增強。適量地使用甜味劑可以使產(chǎn)品獲得良好的口感，又能使食物保持新鮮的味道。

甜菊糖，俗稱甜菊糖苷(stevioside)，是一種植物無熱量代糖品，它是從菊科植物甜葉菊的葉子中提取出來的一種糖苷，甜葉菊的葉含有甜菊醇糖苷的混合物，并在南美用作天然甜味劑已有數(shù)百年歷史。甜菊糖苷的安全性已通過對其分解代謝及其作為食品添加劑的用途的研究得以確定，從而使其在美國和歐盟得到普遍使用。甜菊糖苷由二萜類甜菊醇骨架組成，在骨架上飾有1～3個葡萄糖。甜菊糖的甜度是蔗糖的200～350倍，但熱量卻只有蔗糖的1/300，甜菊糖的甜度高、熱量低，是一種基本不會在人體內(nèi)殘留的天然食品添加劑[4]。因其熱量較低，甜菊糖可以用來制作一些低熱量的食品供給一些特殊人群(如糖尿病、肥胖人群、三高患者)食用。此外，甜菊糖苷具有獨特的清涼、甘甜特點，可以用來制作糖果，也可用作矯味劑，抑制一些藥物或者食品的怪味和苦味。

在所有糖苷中，五糖苷Reb D是最甜的，且苦味低，六糖苷Reb M具有高甜度、快速和干凈味道的特性，因此Reb D和Reb M是目前最優(yōu)質(zhì)的高潛力的天然甜味劑。但是Reb D和Reb M只存在于甜葉菊葉中，且含量非常低(約占干重的 0.4%～0.5%)，這使得從甜葉菊植物中純化這兩種化合物用于工業(yè)用途不切實際且成本高。編碼SGs包括Reb D和Reb M生物合成的基因已被篩選鑒定，SGs的合成途徑已成功在釀酒酵母中表達，酵母微生物提供了Reb D和Reb M的異源生產(chǎn)替代場所[5]。因此，可以通過酵母發(fā)酵來生產(chǎn)存在于甜葉菊葉片中的Reb M和Reb D分子，有望借助微生物發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)下一代甜葉菊甜味劑，據(jù)調(diào)查，預(yù)計到2025年，發(fā)酵法生產(chǎn)的高強度甜菊糖甜味劑市場將超過30億美元。

3 營養(yǎng)強化劑

營養(yǎng)強化劑是指為了增強營養(yǎng)價值而向食品中加入的天然或者人工合成的屬于天然營養(yǎng)素范圍的食品添加劑，這種經(jīng)過添加的食品也被稱為強化食品。食品營養(yǎng)強化劑是一類重要的食品添加劑，用于補充人體部分營養(yǎng)素，在食品中添加營養(yǎng)強化劑可以增強食物的營養(yǎng)成分，增加人們因某些原因所缺少的部分營養(yǎng)，增強身體素質(zhì)，并將影響人們身體健康的風(fēng)險降到最低。營養(yǎng)強化劑的作用不僅僅是減少疾病、調(diào)節(jié)健康，借助營養(yǎng)強化劑預(yù)防疾病甚至治療某些疾病已經(jīng)成為營養(yǎng)強化劑發(fā)展的新方向。

維生素K2是應(yīng)用最早的一種營養(yǎng)強化劑，它能夠有效地預(yù)防血管鈣化和骨質(zhì)疏松以及一些癌癥的發(fā)生，同時能夠補充身體內(nèi)的蛋白質(zhì)，它不但能夠促進凝血酶原的形成，加速凝血，保證凝血的正常，還能夠有效地幫助骨頭和血液保持正常。維生素K2在食品中的含量極少，但也是人體所必需的一部分 ，維生素K2有著“鈾金維生素”之稱，同時維生素K2也被廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)中。

維生素K并非是一種單一的物質(zhì)，而是一類具有醌類結(jié)構(gòu)的脂溶性化合物。維生素K主要分為兩種：第一種是維生素K1，也被稱為葉綠醌，其主要來源于植物中；第二種即維生素K2，主要是微生物代謝產(chǎn)生的，最初來源于納豆。維生素K2，常態(tài)為淡黃色粉末狀。通常腸道內(nèi)的細菌可以合成維生素K2，一般不會引起缺乏，但當大量使用抗菌素，腸道細菌不能合成維生素K時，會引起缺乏癥。維生素K2是一類具有相同2-甲基-1,4-萘醌環(huán)不同長度側(cè)鏈的系列衍生物，由于異戊二烯側(cè)鏈在C-3上的長度不同，維生素K2可以分為14種，分別以MK-n表示(其中n表示側(cè)鏈異戊二烯單位數(shù))。其中，MK-7是維生素K2中最具生物活性形式的。

以前，人們主要從奶酪和日本納豆等食物中獲得維生素K2，但維生素K2在食品中含量非常少，因此通過細菌發(fā)酵是天然產(chǎn)生該活性成分的最好方法。然而MK產(chǎn)量較高的菌種不多，目前主要利用枯草桿菌(Bacillussubtilis)[6]來發(fā)酵生產(chǎn)MK-7。Natto Pharma公司利用具有高生產(chǎn)能力的芽孢桿菌，并以蔬菜基質(zhì)來發(fā)酵生產(chǎn)MK-7，經(jīng)提取純化和濃縮后，可獲得不含已知過敏原的優(yōu)質(zhì)活性成分。目前，對微生物法生產(chǎn)維生素K2的研究主要體現(xiàn)在菌種的誘變和發(fā)酵條件的優(yōu)化上。Yoshinori 等[7]利用紫外和亞硝基胍結(jié)合的誘變方法，篩選得到一株BacillussubtilisOUV23481高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量高達1719 μg/100 g，是出發(fā)菌株產(chǎn)量的2倍。最近，Novin等[8]利用牛奶作為培養(yǎng)基發(fā)酵Bacillussubtilisnatto生產(chǎn)維生素K2，經(jīng)過條件優(yōu)化后，制備得到一種富含MK-7(3.54 mg/L)的乳制品。國內(nèi)方面，杜亞飛等[9]對納豆芽孢桿菌進行DES誘變和紫外誘變，篩選得到維生素K2高產(chǎn)的營養(yǎng)缺陷型菌株，并通過響應(yīng)面優(yōu)化，產(chǎn)量最終達到51.23 mg/L。

4 功能性食品添加劑

目前的研究結(jié)果表明，大多數(shù)食品除了自身具有營養(yǎng)功能和感覺功能外，還具有調(diào)節(jié)高級生命活動的功能，具備該特性的食品又被稱為功能食品，而其中的有效成分則能稱為功能性食品成分。這些功能成分具有生理活性，它們可對體內(nèi)固有的生理調(diào)節(jié)因子發(fā)生刺激作用，或與體內(nèi)的特定組織器官發(fā)生作用，使其功能增強或受到抑制，從而對生命活動進行調(diào)節(jié)。

蝦青素(蝦紅素)，是一種橙紅色脂溶性的類胡蘿卜素，易溶于有機溶劑中，具有較強的天然抗氧化性，被稱為“超強維生素”，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的自然界中最強的一種抗氧化劑。在自然界中，蝦青素大都存在于微生物(如酵母、微藻、細菌)、甲殼類動物(如蝦、蟹等)、魚類和一些鳥類的體內(nèi)[10]。蝦青素具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等生物學(xué)功能，因此具有廣闊的開發(fā)潛力，在化妝品、保健品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖和飼料添加劑等方面均具有很大的利用價值和發(fā)展?jié)摿?，常被作為功能性食品添加劑用于食品、保健品或藥品中，對改善人類健康具有切實意義。同時，蝦青素還具有提高水產(chǎn)動物產(chǎn)卵率、促進生長和抗病防病的效果。在過去，人們主要從甲殼類動物中提取蝦青素，但是其經(jīng)濟和環(huán)境成本較高。蝦青素也可通過化學(xué)合成的方法獲得，但化學(xué)合成蝦青素費用昂貴，且多為順式結(jié)構(gòu)，與天然蝦青素不同?，F(xiàn)在，人們更傾向于利用酵母發(fā)酵的方法來生產(chǎn)蝦青素，這種方法具有易操作、環(huán)境友好、成本低等優(yōu)勢，且蝦青素提取后的菌體單細胞蛋白可作為飼料添加劑，是一種極具產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素生產(chǎn)方法。Nextferm Technologies公司利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)的蝦青素與藻類來源的蝦青素相比，該蝦青素具有略微不同的微型結(jié)構(gòu)，能夠被迅速有效地吸收，從而提高其生物利用度，其功效是其他蝦青素的4倍。目前，對于蝦青素的發(fā)酵研究主要集中于蝦青素高產(chǎn)菌株的篩選和改造上，其中紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量較高，是實現(xiàn)蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的途徑之一[11]。

EPA與DHA是兩種人體必需的多不飽和脂肪酸，一般存在于海藻和深海魚類的脂肪中。EPA和DHA對人體的健康有著重要的意義，EPA可以預(yù)防心血管疾病、免疫性疾病、牛皮癬、風(fēng)濕病和腸道疾病等[12]，而DHA能夠治療抑郁癥、保護視力和促進嬰幼兒腦部發(fā)育[13]。目前，EPA和DHA的主要來源仍然是魚油，但是魚油的質(zhì)量受到魚的種類、捕捉季節(jié)和捕捉地域的限制，魚油成分復(fù)雜、異味重，純化成本非常高，這大大阻礙了EPA和DHA的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，微生物包括藻類、海洋細菌和真菌，都能合成EPA和DHA等不飽和脂肪酸。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的EPA和DHA具有穩(wěn)定性較好，可以人為控制，更易于分離純化和工業(yè)化等優(yōu)點，這也是近年來研究的熱點。其中，裂殖壺菌可通過異養(yǎng)繁殖生長，其生長繁殖快，耐受機械攪拌，適宜發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。美國Martek公司已成功利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA，生物量干重可達到170～210 g/L，其中脂質(zhì)占50%[14]。目前，該菌已被用于DHA的工業(yè)化生產(chǎn)，其細胞油脂含量高，其發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)不受季節(jié)影響，無毒物污染，成分穩(wěn)定，并已被美國及歐洲有關(guān)食品權(quán)利機構(gòu)批準添加至相關(guān)食物中使用。國內(nèi)外常見的裂殖壺菌生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸主要以DHA為主，產(chǎn)量在0.33～41.3 g/L之間，而生產(chǎn)EPA較少，這一方面的研究工作還有待加強。

5 多糖類食品添加劑

生物多糖是由通過糖苷鍵連接的長鏈單糖單元組成的高分子碳水聚合物，天然產(chǎn)物中多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，支鏈結(jié)構(gòu)多樣，但其主鏈的基本結(jié)構(gòu)通常是葡聚糖、木聚糖、果聚糖、半乳聚糖及甘露聚糖等，或者是兩種或多種單糖的聚合物，根據(jù)聚合度和分子量不同，可分為低聚糖和高聚糖。越來越多的研究[15-16]表明許多生物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂和提高免疫力等功效，可以當作營養(yǎng)強化劑來增強食品的功能，在食品工業(yè)中還可以作為增稠劑和保鮮劑使用，此外生物多糖還能防止淀粉老化，改良淀粉品質(zhì)。因此，生物多糖的提取及生產(chǎn)技術(shù)的研究日益受到廣泛關(guān)注。生物多糖在自然界中廣泛存在，可從高等植物、真菌、藻類和細菌等中獲得。從植物中直接提取分離的多糖純度和效率較低。目前，微生物發(fā)酵技術(shù)已成功用于發(fā)酵生產(chǎn)細菌和真菌多糖，也有利用微生物發(fā)酵技術(shù)促進生物多糖的釋放及生物活性。

靈芝是一種名貴的食藥用真菌，在食品中的應(yīng)用非常廣泛，不僅可以作為藥品和功能性保健食品使用，還可作為添加劑被制作成各種功能性復(fù)合調(diào)味品，如靈芝醬油和靈芝醋等[17]。作為靈芝最重要的藥理活性成分之一，靈芝多糖具有重要的生物學(xué)功能，除了具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等生物活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖等藥理作用，傳統(tǒng)栽培的靈芝容易受到環(huán)境、栽培方式等因素的影響，且生長條件難以控制，導(dǎo)致質(zhì)量差異較大，子實體中活性成分質(zhì)量不穩(wěn)定，而且生產(chǎn)周期較長，靈芝栽培成本較高。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，目前具有操作簡單、周期短、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點的液體發(fā)酵技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于靈芝多糖的生產(chǎn)。Feng J等[18]利用液體深層發(fā)酵技術(shù)對靈芝菌絲體進行發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖，并通過中心復(fù)合試驗設(shè)計法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，在5 L和50 L發(fā)酵罐中，靈芝多糖的產(chǎn)量分別高達2.59，2.65 g/L，有效地提高了靈芝多糖的產(chǎn)量，且獲得的靈芝多糖具有良好的免疫活性，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝可以用于靈芝多糖的大規(guī)模生產(chǎn)。

鐵皮石斛是另外一種重要的藥材，具有極高的藥用和食用價值，也被廣泛用于調(diào)味品如醬油、調(diào)味汁和料酒中，以增強調(diào)味品的營養(yǎng)，而鐵皮石斛多糖的含量和活性決定了鐵皮石斛的品質(zhì)。微生物具有豐富的酶系，能夠分解轉(zhuǎn)換物質(zhì)并且合成次級代謝產(chǎn)物。鐵皮石斛的成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得其活性物質(zhì)尤其是多糖被包裹，藥性不能得到完全釋放。通過微生物發(fā)酵技術(shù)可以破壞鐵皮石斛的細胞壁，促進中藥活性物質(zhì)的釋放， 提高多糖的提取率，此外微生物還可以通過代謝提高多糖的生物活性。王丹等[19]利用不同的微生物對鐵皮石斛水提液進行純種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵可以降低鐵皮石斛多糖的分子量，并且可以提高鐵皮石斛的抗氧化活性和體外降血糖活性，為純天然綠色鐵皮石斛的多糖研制成降糖保健品奠定了基礎(chǔ)。

水蘇糖是一種天然存在的功能性低聚糖，能夠增殖腸道益生菌，抑制腐敗菌生長，具有促進腸道蠕動的作用，同時水蘇糖還能保護肝功能，增強機體免疫力，可以作為一種新型食品添加劑使用。從天然原料中直接提取的水蘇糖產(chǎn)品純度較低，限制了它的應(yīng)用。舒丹陽等[20]以草石蠶糖液為原料，利用混菌發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)高純度水蘇糖，精制純化后的水蘇糖含量高達78.13%，為高純度水蘇糖的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了理論和實踐指導(dǎo)。

6 結(jié)論與展望

發(fā)酵是一個非常復(fù)雜的生物過程，需要無懈可擊的衛(wèi)生措施和嚴格精密的條件控制，以確保所需的微生物能夠不受有害微生物的影響，并且滿足人類的生產(chǎn)要求，隨著科技水平的快速提升，發(fā)酵工程技術(shù)也得到了不斷的發(fā)展?？傮w來說，相比直接提取和化學(xué)合成法，發(fā)酵能產(chǎn)生更高質(zhì)量和高純度的成分，而且發(fā)酵過程是安全可控、可追溯的，相信發(fā)酵生產(chǎn)的食品原料能夠得到大多數(shù)消費者的認可。

隨著社會的進步，人們也愈發(fā)注重食品的質(zhì)量與安全問題，食品添加劑在人們的生活中也更為常見，利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)食品添加劑已經(jīng)十分廣泛。另外，隨著基因工程的發(fā)展，人們可以有針對性地將目的產(chǎn)物的基因?qū)氲娇莶菅挎邨U菌或者酵母這些安全的宿主菌中進行表達，再結(jié)合發(fā)酵工程技術(shù)來生產(chǎn)相應(yīng)的食品添加劑，不僅能夠提升食品的開發(fā)效率，同時也能夠保障食品的品質(zhì)。相信在未來運用發(fā)酵工程技術(shù)能夠安全有效地生產(chǎn)出越來越多的新型食品添加劑，而食品也會變得越來越健康、美味。