苗穎,南海娟,郝亞勤,趙圣明,黃少帥

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南加多多食品有限公司,河南新鄉(xiāng)453003）

大豆胚芽具有很高的營養(yǎng)價值,其富含生理活性物質(zhì)維生素E,大豆異黃酮和甾醇等.黃酮類化合物又名生物類黃酮化合物,是色原酮或色原烷的衍生物,目前檢測總黃酮含量的方法有紫外分光光度法[1]、熒光分光光度法[2]以及高效液相法[3]等.

黃酮類化合物能預(yù)防多種疾病,是保健食品的功能因子之一[4].通常,黃酮類化合物的提取工藝主要有萃取法、超濾法、超聲波法、微波消解等方法[5-7],其中萃取法應(yīng)用最為廣泛.醇提法是在萃取法中常用的單元操作,而乙醇的濃度、提取時間和提取溫度等因素對目標(biāo)提取率有較大的影響.因此,如何選擇適宜的提取條件顯得尤為重要.

利用響應(yīng)面分析法可建立提取條件和提取率的數(shù)學(xué)模型,預(yù)測最優(yōu)的提取條件和提取率,是一種解決多變量問題的科學(xué)統(tǒng)計(jì)方法.本研究以大豆胚芽為試驗(yàn)材料,采用乙醇提取工藝借助響應(yīng)面分析法對大豆胚芽中的黃酮進(jìn)行提取,旨在獲得最佳提取工藝,為大豆胚芽的綜合利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料 大豆胚芽,由鄭州鑫鑫豆制品加工廠提供.

1.1.2主要試劑 葛根素、AlCl3、NaOH、無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3,均為分析純.

1.1.3儀器與設(shè)備ZM-2248中藥材粉碎機(jī),廣州真麥機(jī)械設(shè)備有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,金振華峰儀器有限公司；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,金振華峰儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵,河南智誠科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-599,河南智誠科技發(fā)展有限公司；L420臺式低速自動平衡離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DZF-6050型真空干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黃酮的定性 鹽酸-鎂粉（或鋅粉）反應(yīng)為鑒定黃酮類化合物最常用的顏色反應(yīng),因?yàn)辄S酮類化合分子中含的結(jié)構(gòu)單元,?？膳c鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽、鍶鹽、鐵鹽等試劑反應(yīng),生成有色絡(luò)合物[8].

（1）取樣品提取液于試管中,滴加FeCl3溶液,若顯墨綠色,滴加NaOH顯橙紅色,說明有黃酮類物質(zhì).（2）取樣品提取液于試管中,加入數(shù)滴AlCl3溶液,若變?yōu)辄S色,證明提取液中有黃酮類物質(zhì).

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg,置于250 mL容量瓶中,以蒸餾水溶解后定容至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別準(zhǔn)確量取0.0,5.0,10.0,15.0,20.0 mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,在波長250 nm處測定其吸光值,繪制葛根素含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3大豆胚芽的樣品處理及總黃酮含量的測定方法

1.2.3.1樣品處理方法 大豆胚芽經(jīng)60℃烘干,粉碎,過80目的篩子,得大豆胚芽粉,即為樣品.將樣品放入密封的玻璃瓶中,待用.

1.2.3.2總黃酮的測定方法 稱取3 g樣品,放入錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇150 mL,于50℃水浴中振蕩提取4 h后抽濾,濾液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶,濾渣再移入錐形瓶,加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇150 mL,50℃振蕩水浴提取4 h,連續(xù)3次,每次抽濾.然后將所有濾液在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h左右,當(dāng)濾液剩余8～10 mL,倒入培養(yǎng)皿中,真空干燥8 h,最后加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至50 mL,按1.2.2的方法測定吸光值,樣品中總黃酮含量的計(jì)算公式為

式（1）中：A為吸光度,M/g為樣品質(zhì)量,V/mL為定容體積.

1.2.4大豆胚芽中黃酮最佳提取條件的確定

1.2.4.1單因素試驗(yàn)

1.2.4.1.1提取時間 向100 mL錐形瓶中加入0.4 g樣品,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,提取溫度為40℃,液料比50,時間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min,水浴振蕩提取.提取結(jié)束后,冷卻離心,取上清液定容后,按1.2.2中的方法測吸光度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的黃酮的量.用求得的黃酮量除以總黃酮量,即可得出大豆胚芽中黃酮的提取率.考察提取時間對大豆胚芽黃酮提取率的影響.

1.2.4.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù) 向100 mL錐形瓶中加入0.4 g樣品,提取時間為1.2.4.1.1中的最優(yōu)結(jié)果,提取溫度為40℃,液料比50,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%,提取過程及黃酮測定方法同1.2.4.1.1,考察乙醇濃度對大豆胚芽黃酮提取率的影響.

1.2.4.1.3提取溫度 向100 mL錐形瓶中加入0.4 g樣品,提取時間為1.2.4.1.1中的最優(yōu)結(jié)果,乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.2.4.1.2中的最優(yōu)結(jié)果,液料比50,提取溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃,提取過程及黃酮測定方法同1.2.4.1.1,考察提取溫度對大豆胚芽黃酮提取率的影響.

1.2.4.1.4液料比 向100mL錐形瓶中加入0.4g樣品,提取時間為1.2.4.1.1中的最優(yōu)結(jié)果,乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.2.4.1.2中的最優(yōu)結(jié)果,提取溫度為1.2.4.1.3中的最優(yōu)結(jié)果,液料比為別為30、40、50、60、70,提取過程及黃酮測定方法同1.2.4.1.1,考察液料比對大豆胚芽黃酮提取率的影響.

1.2.4.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法 使用軟件（Design-ExpertSoftware7.0）中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法,以提取率為響應(yīng)值,將單因素試驗(yàn)得到的最佳條件為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)提取溫度、提取時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果擬合數(shù)學(xué)模型,對模型預(yù)測的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證.

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮定性

（1）取5mL樣品提取液于試管中,滴加3滴FeCl3溶液,提取液顯墨綠色；

（2）取5mL樣品提取液于試管中,加1mLNaOH溶液,提取液顯橙紅色；

（3）取5mL樣品提取液與試管中,加入4滴AlCl3溶液,提取液變?yōu)辄S色,可證明提取液中有黃酮[9].

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

用TU-1810紫外可見分光光度計(jì)對樣品進(jìn)行全波長掃描后得最大吸收波長為250nm,以葛根素含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程y=0.1158x+0.0083,R2=0.9999,表明吸光度值與葛根素含量有良好的線性關(guān)系見圖1.

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standardcurveofpuerarinstandardsolution

2.3 大豆胚芽中黃酮總含量的測定結(jié)果

大豆胚芽中總黃酮含量見表1.

表1大豆胚芽中總黃酮含量Tab.1Thecontentoftotalflavonoidsinsoybeangerm

2.4 大豆胚芽中黃酮最佳提取條件的確定

2.4.1單因素試驗(yàn)

2.4.1.1提取時間對黃酮提取率的影響 提取時間對提取率的影響見圖2.

由圖2可知,黃酮的提取率隨時間的增加先增大后減小,60min時提取率最大.這是因?yàn)閯傞_始時黃酮類化合物還未充分溶出,隨著提取過程的進(jìn)行,大豆胚芽中的黃酮逐漸溶入提取液.若提取時間過短,黃酮溶解不充分,提取率較低.但是提取時間過長,提取率也有所下降,這是因?yàn)樗≌袷幘哂休^強(qiáng)的機(jī)械剪切作用,長時間的作用會破壞黃酮的結(jié)構(gòu),降低黃酮的提取率,同時組織中大量破裂的細(xì)胞,增加了溶液中的雜質(zhì)含量,使有效成分的溶出受到影響[10].此外長時間的加熱,乙醇揮發(fā)量增大,導(dǎo)致溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)降低,從而降低了黃酮的提取效率.因此,最佳的提取時間為60min.

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 The effect of extraction times on the extraction rate in soybean germ

2.4.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響見圖3.

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

由圖3可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,大豆胚芽黃酮的提取率先增大后減小.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時,提取率最大.原因可能是樣品中的一些親脂類的雜質(zhì)在高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中也可溶出而進(jìn)入溶液中.因此,高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液會使樣品中的親脂類物質(zhì)和黃酮競爭性地進(jìn)入溶劑體系中,當(dāng)親脂類的物質(zhì)溶出較多時,黃酮的提取率反而降低[11].另外,高體積分?jǐn)?shù)的乙醇勢必提高提取的成本,因此,最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%.

2.4.1.3溫度對大豆胚芽中黃酮提取率的影響 不同溫度對大豆胚芽中黃酮提取率的影響見圖4.

圖4 溫度對提取率的影響Fig.4 The effect of temperature on the extraction rate

由圖4可知,隨著溫度升高,提取率逐漸增加,50℃時達(dá)到最大,隨后開始下降,原因可能是較高的溫度會對黃酮的活性和結(jié)構(gòu)有一定的影響[12].因此,最佳提取溫度為50℃.

2.4.1.4液料比對大豆胚芽中黃酮提取率的影響 不同液料比對大豆胚芽中黃酮提取率的影響見圖5.

圖5 液料比對提取率的影響Fig.5 The effect of liquid-material ratio on the extraction rate

由圖5可知,在液料比為50之前,隨著液料比的增加提取率不斷增大,由于液料比的增加,溶劑與浸提物的接觸越充分,能在相同時間內(nèi)溶解出更多的黃酮,相應(yīng)黃酮提取率就高.如果液料比過小,就沒有足夠的溶劑浸取出樣品中的黃酮,從而使提取率降低.如果液料比過大,會消耗更多的能量和時間,同時使細(xì)胞破碎程度下降,從而降低黃酮的提取率[13].因此,最優(yōu)液料比為50.

2.4.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)法 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素水平表見表2,響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3.

表2因素和水平Tab.2 Factors and levels of experimentation

表3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of response surface experiment

經(jīng)Design-Expert Software7.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,擬合得到二次方程式.此黃酮提取率的數(shù)學(xué)模型如下

R1=77.51-1.06×A+0.55×B-0.87×C+1.41×D+0.10×AB+1.41×AC+0.095×AD+0.77×BC-0.16×BD+1.00×CD-0.47×A2-0.74×B2-0.41×C2-0.15×D2.

式中：A/min為提取時間；B/℃為提取溫度；C/%為乙醇體積分?jǐn)?shù)；D為液料比；R1/%為黃酮提取率.黃酮提取率回歸方程方差分析表見表4.

表4方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

由表4的Pro＞F值可知,因素的影響次序?yàn)椋阂毫媳龋咎崛r間＞乙醇濃度＞提取溫度.提取時間的概率值（Pr＞F）＜0.05,說明時間對提取率影響顯著,液料比的概率值（Pr＞F）＜0.01,說明液料比對提取率的影響極顯著.模型的概率值（Pr＞F）＜0.01,說明該模型是極顯著的,能較好地?cái)M合大豆胚芽黃酮的提取條件.

使用Design-Expert Software7.0優(yōu)化大豆胚芽中黃酮理論適宜提取條件見表5.

表5 Design-Expert軟件給出的大豆胚芽中黃酮提取的適宜條件Tab.5 Optimum conditions of extracting flavonoids from soybean germ given by design expert software

為了便于實(shí)際操作,將最佳工藝條件修正為：提取溫度46.8℃,提取時間60 min,液料比50,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%.對適宜提取條件的驗(yàn)證結(jié)果見表6.

表6適宜提取條件的驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 Validation results of optimumconditions

由表6可知,在修正條件下提取大豆胚芽黃酮的提取率為80.11%,與回歸模型的預(yù)測值80.22%僅相差0.10%,因此回歸方程較好地預(yù)測了大豆胚芽黃酮的提取率.

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)建立了以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇水浴振蕩提取液進(jìn)行處理,紫外分光光度法測定大豆胚芽中總黃酮含量的方法,測得原料中總黃酮的含量為10.05 mg/g.

（2）采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮最佳提取條件為：溫度46.8℃,時間60 min,液料比50,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,在此工藝條件下提取大豆胚芽中黃酮提取率較高,提取率可達(dá)80.11%.