薛建鵬，劉少鋒，汪瑾，杜南星，宋如錚，李瑜玲，張清昕，徐寒梅

（中國藥科大學(xué) 江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)工程研究中心，江蘇 南京210009）

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）是一類依賴于鋅離子和鈣離子的內(nèi)源性蛋白水解酶，可由成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞合成和分泌。MMPs可分為膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶素類、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinase，MTMMPs）、基質(zhì)溶解酶和其他MMPs，主要參與組織重構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解等重要生理過程[1]。細(xì)胞外基質(zhì)分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間，由基底膜（basement membrane，BM）和細(xì)胞間基質(zhì)組成，具有阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。因此，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的早期步驟。

MMP-2和MMP-9是最重要的MMPs，在胰腺癌[2-3]、乳腺癌[4-5]、膀胱癌[6-8]、宮頸癌[9-10]等多種腫瘤中都有異常表達(dá)，在腫瘤生理和病理進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用。腫瘤微環(huán)境中的MMP-2和MMP-9高度特異性表達(dá)，可以降解腫瘤細(xì)胞表面的主要結(jié)構(gòu)成分，使腫瘤細(xì)胞從缺失的BM向周圍組織浸潤，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11]（見圖1）。因此，通過構(gòu)建檢測MMP-2/9活性的探針并利用MMP-2/9的底物特異性進(jìn)行成像，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)估，從而進(jìn)行及時(shí)治療。因此，本文針對(duì)檢測MMP-2/9的響應(yīng)型多肽探針構(gòu)建的機(jī)制及相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

圖1 MMP-2/9所介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移Figure 1 MMP-2/9-mediated tumor metastasis

1 常用基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測方法

目前，在對(duì)MMPs進(jìn)行定性分析時(shí)，最常用的檢測方法是明膠酶譜法（zymography）。明膠酶譜法利用非還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 電 泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和反向凝膠染色來檢測MMPs的活性，但該方法存在如MMPs的變性和復(fù)性步驟耗時(shí)長、孵育液含劇毒藥物等缺陷。此外，體內(nèi)組織中還存在組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP），其能以共價(jià)鍵的形式與MMPs結(jié)合成復(fù)合體，特異性抑制MMPs的活性。TIMP的存在對(duì)MMPs活性的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此明膠酶譜法僅適用于定性而非定量分析。

在對(duì)MMPs進(jìn)行定量分析時(shí)，最常用的檢測技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA分析法利用抗原抗體專一性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MMPs等蛋白酶的定性和定量檢測，具有較高的檢測靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)濃度水平較低的MMPs進(jìn)行檢測和定量計(jì)算。但是ELISA分析法需要多次孵育和清洗抗體，操作繁瑣耗時(shí)，此外，對(duì)MMPs準(zhǔn)確定量時(shí)還需要價(jià)格昂貴的特異性抗體，因此在腫瘤臨床診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用也受到限制。

為了實(shí)現(xiàn)MMPs活性的簡單、快速檢測，基于比色法[12-13]和電化學(xué)測量法[14]的熒光檢測法[15-16]正在逐漸被開發(fā)。熒光檢測法大多都是基于多肽檢測探針的構(gòu)建，該方法實(shí)驗(yàn)操作快速簡便、數(shù)據(jù)全面、測定結(jié)果較為可靠。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞和組織內(nèi)活性物質(zhì)“定時(shí)、定量、定位、動(dòng)態(tài)”的高靈敏度檢測。

基于熒光檢測法設(shè)計(jì)的多肽探針是一種廣泛應(yīng)用的蛋白酶檢測手段，作為生物探針，其具有相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性高、響應(yīng)穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能與待測蛋白酶作用并產(chǎn)生熒光作為檢測的信號(hào)，因而可以用于響應(yīng)蛋白的分子成像，提供精確和專一的疾病診斷信息，在復(fù)雜生物樣品的分離分析領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

2 基質(zhì)金屬蛋白酶的響應(yīng)型多肽探針檢測法

近年來，基于MMPs活性的多肽探針已被廣泛報(bào)道，為檢測腫瘤惡性程度和轉(zhuǎn)移情況提供了一種簡便、靈敏的實(shí)時(shí)檢測方法。按照探針構(gòu)建原理可以將其分為： 1）基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的 多 肽 探 針； 2）基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）的多肽探針。

2.1 檢測MMP-2/9的響應(yīng)型FRET多肽探針構(gòu)建機(jī)理

FRET是一種重要的光物理技術(shù)，常用于檢測2個(gè)蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。在FRET系統(tǒng)中，距離較近的2個(gè)基團(tuán)中能量供體分子將能量轉(zhuǎn)移給能量受體分子，產(chǎn)生了一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。近年來FRET在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，其在研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能及相互作用、細(xì)胞器功能和活細(xì)胞信號(hào)通路等方面均有應(yīng)用。利用FRET原理的MMP-2/9的響應(yīng)型多肽熒光探針已被大量的開發(fā)，適用于對(duì)體內(nèi)細(xì)胞和組織的MMP-2/9實(shí)時(shí)檢測。這些探針的結(jié)構(gòu)主要由MMP-2/9活性底物肽鏈、FRET系統(tǒng)能量供體、FRET系統(tǒng)能量受體和其他附加基團(tuán)組成（見圖2）。

圖2 MMP-2/9活性肽的熒光探針的結(jié)構(gòu)Figure 2 The Structure of fluorescent probe of MMP-2/9

目前已構(gòu)建成功的檢測MMP-2的響應(yīng)型熒光多肽探針中，MMP-2的主要識(shí)別位點(diǎn)為GV和GL（見表1），最常見的特異性底物片段是PLGVR。MMP-9的識(shí)別位點(diǎn)較多，其底物片段如表2所示。

表1 MMP-2的識(shí)別位點(diǎn)Table 1 Recognition sites of MMP-2

表2 MMP-9的識(shí)別位點(diǎn)Table 2 Recognition sites of MMP-9

2.2 檢測MMP-2/9的響應(yīng)型FRET多肽探針作用機(jī)制

MMP-2/9活性熒光成像探針在初始時(shí)形成FRET系統(tǒng)，能量受體-多肽-能量供體所構(gòu)成的多肽檢測探針結(jié)構(gòu)完整，能量受體猝滅能量供體的熒光，探針為熒光猝滅狀態(tài)，故無熒光產(chǎn)生，F(xiàn)RET系統(tǒng)建立。當(dāng)MMP-2/9催化探針的活性肽水解時(shí)，F(xiàn)RET系統(tǒng)遭到破壞（多肽鏈斷開），故能量受體不能猝滅能量供體的熒光，能量供體發(fā)射較強(qiáng)熒光，因此可通過熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)反映酶的活性和酶在組織與細(xì)胞間的表達(dá)情況。構(gòu)建酶活性熒光成像探針檢測MMP-2/9的活性具體機(jī)制如圖3所示。

圖3 FRET的多肽探針檢測MMP-2/9Figure 3 Detection of MMP-2/9 by peptide probes of FRET

2.3 MMPs的響應(yīng)型FRET多肽探針的應(yīng)用

2.3.1 MMPs的響應(yīng)型FRET多肽探針在腫瘤診斷中的應(yīng)用根據(jù)MMPs在腫瘤微環(huán)境中的特性，研究人員利用其響應(yīng)多肽探針對(duì)腫瘤進(jìn)行檢測，并得到了良好的反饋。Oriana等[37]利用FRET原理，設(shè)計(jì)并合成了用于檢測MMP-2活性的多肽探針。在較溫和的條件下，通過Michael加成反應(yīng)和KAHA連接反應(yīng)，將MMP-2底物片段Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly、FRET能量供體甲氧基香豆素乙酸（methoxycoumarin acetic acid，MCA）、FRET能量受體二硝基苯胺（dinitrophenylamine，DNP）與聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）連接成MMP-2活性多肽探針。他們用該探針與隨機(jī)多肽序列合成的陰性對(duì)照探針分別進(jìn)行了體外熒光光譜分析。結(jié)果顯示，在pH = 7.5的Tris緩沖液中，完整的MMP-2活性的多肽探針和陰性對(duì)照探針均呈現(xiàn)低熒光發(fā)射；分別加入MMP-2后，觀察到MMP-2活性響應(yīng)的多肽探針的熒光發(fā)射顯著增加，而陰性對(duì)照探針仍只顯示微弱的熒光，證明該探針可以應(yīng)用體外MMP-2的檢測。

利用FRET原理設(shè)計(jì)合成的多肽探針應(yīng)用于蛋白酶的檢測已有很多報(bào)道，而多功能、多靶點(diǎn)的多肽熒光探針也正被逐漸開發(fā)。Cheng等[38]設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種新穎的單分子多肽熒光探針，可以對(duì)人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080和鱗癌細(xì)胞SCC-7的MMP-2和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）進(jìn)行同時(shí)、實(shí)時(shí)成像。該探針的活性多肽片段特異性較強(qiáng)，其對(duì)MMP-2和Caspase-3的成像選擇性較好。此外，該多肽熒光探針涉及2個(gè)FRET過程，因此對(duì)MMP-2的成像和Caspase-3的成像過程相互獨(dú)立，滿足了對(duì)癌癥進(jìn)行精確診斷和治療的要求。

2.3.2 MMPs的響應(yīng)型FRET多肽探針在關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用MMPs能夠降解軟骨細(xì)胞賴以生存的細(xì)胞外基質(zhì)，使其合成與降解失衡，導(dǎo)致軟骨退變和關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。Lee等[39]及Sun等[40]設(shè)計(jì)了另一個(gè)MMP-13的活性多肽探針。MMP-13底物序列為Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- Gly-Lys。這個(gè)探針經(jīng)過 Cy5.5 和BHQ-3（black hole quencher-3）標(biāo)記后，在體外的對(duì)MMP-13檢測實(shí)驗(yàn)中，熒光值增加了近30倍。在抑制實(shí)驗(yàn)中，加入MMP-13的抑制劑后，再與多肽探針孵育，未發(fā)現(xiàn)明顯的熒光值增加。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，注射MMP-13的活性多肽探針到關(guān)節(jié)炎模型大鼠中，利用光學(xué)成像系統(tǒng)成像，發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎部位有明顯的熒光信號(hào)，而在大鼠其他健康部位未有明顯熒光信號(hào)。

2.4 MMPs的響應(yīng)型FRET多肽探針的優(yōu)化

2.4.1 提高多肽探針的穩(wěn)定性穩(wěn)定的探針結(jié)構(gòu)是有效遞送探針、增加成像分辨率的先決條件。Chen等[41]提出了一種檢測體內(nèi)和體外MMPs表達(dá)水平的方法，即建立甲氧基聚乙二醇-納米金-MMPs活性多肽片段-異硫氰酸熒光素（mPEG-GNP-Peptide-FITC）探針， 直接、準(zhǔn)確地反映MMP-2、MMP-4和MMP-9的活性及其在體內(nèi)的分布狀況。該探針的設(shè)計(jì)基于FRET原理，以納米金粒子為能量受體猝滅能量供體FITC。納米金粒子具有形狀尺寸可控、表面修飾能力強(qiáng)、物理化學(xué)性質(zhì)可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，因此成為生物傳感器研究的熱點(diǎn)。此外， mPEG也結(jié)合到納米金的表面，穩(wěn)定探針結(jié)構(gòu)，減少探針被非特異性酶破壞并避免免疫細(xì)胞的清除，最后以探針形式在體內(nèi)延長循環(huán)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米金能增強(qiáng)HepG2肝癌細(xì)胞對(duì)探針的吸收能力，提高探針在Heps荷瘤小鼠的組織滲透性。此外，該納米金探針在正常組織中的分布較低，在肝組織有較高的分布。這種新型的納米金-多肽探針有望應(yīng)用于活體肝癌的特異性成像，為肝癌的篩查、早期診斷和預(yù)后判斷提供一種無創(chuàng)的成像手段。

2.4.2 提高腫瘤檢測的靈敏度盡管腫瘤檢測方法在不斷改進(jìn)，但臨床血液分析、醫(yī)學(xué)影像技術(shù)仍難以檢測出直徑小于1 cm的腫塊和腫瘤脫落的生物標(biāo)記物。Kwong等[42]合成了利用無創(chuàng)操作檢測尿液中MMPs活性的納米多肽探針。靜脈注射給藥后，這種檢測探針首先響應(yīng)聚集在腫瘤發(fā)生部位并被MMPs裂解，裂解后的探針?biāo)槠^濾到尿液中。最后，對(duì)尿液進(jìn)行紫外-可見分光光度法分析和質(zhì)譜分析。在此基礎(chǔ)上，Kwon等[43]合成了高靈敏度、強(qiáng)穿透力的檢測腫瘤患者尿液中MMP-9活性的多肽探針。為了驗(yàn)證該探針對(duì)人體腫瘤樣本的響應(yīng)，研究人員將MMP-9活性多肽探針法所能檢出的腫瘤的體積和血液生物標(biāo)志物HE4檢測法所能檢出的腫瘤的體積進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示該探針更加靈敏，能檢測出體積更小的腫瘤。在檢測時(shí)間上相比，MMP-9活性多肽探針比HE4檢測法提前5個(gè)月檢測出原位腫瘤。該探針顯著提高了對(duì)MMP-9的特異性，減少了探針脫靶的幾率并增強(qiáng)了探針在腫瘤組織的穿透力，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷并改善患者的預(yù)后。

2.4.3 引入生物相容性材料Lee等[39]將FRET系統(tǒng)的能量供體分子羅丹明B包裹在PLGA-PEI納米粒中，并在納米粒表面修飾多肽探針。用陽離子改性劑聚醚酰亞胺（polyetherimide，PEI）和生物相容性材料聚乙丙交酯（poly lactide-coglycolide， PLGA）制成的納米粒明顯增強(qiáng)了探針的細(xì)胞滲透性，且無細(xì)胞毒性反應(yīng)。通常情況下，納米成像探針可在被動(dòng)的滲透和滯留效應(yīng)（permeability and retention effect，EPR）下響應(yīng)并積聚在腫瘤組織。目前開發(fā)的許多MMPs的響應(yīng)型多肽探針，其檢測范圍也大多僅限于腫瘤細(xì)胞外部及周圍區(qū)域，容易被血液中的蛋白酶迅速清除，探針難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生穩(wěn)定的檢測信號(hào)。細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）的引入可以增加探針的細(xì)胞滲透性，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)酶活的實(shí)時(shí)測定。Sun等[40]將MMP-2多肽底物片段與CPPs連接起來，設(shè)計(jì)了可以穿透腫瘤細(xì)胞膜屏障的探針，該探針可實(shí)時(shí)反映特定腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMP-2的活性。

2.4.4 克服腫瘤組織其他代謝物質(zhì)的干擾腫瘤微環(huán)境中一些生化物質(zhì)如硫醇類的積累對(duì)MMPs的檢測也帶來了一定干擾。Gao等[20]發(fā)現(xiàn)巰基化合物（谷胱甘肽）和MMPs均可以與納米金形成金-硫鍵，競爭結(jié)合納米金修飾的多肽探針，造成檢測信號(hào)失真，出現(xiàn)假陽性的腫瘤診斷結(jié)果。為了克服這個(gè)問題，他們將納米金替換為納米金-硒設(shè)計(jì)出了新的多肽探針。硒能迅速打破金-硫鍵，與金形成更穩(wěn)定的金-硒鍵。在模擬生理?xiàng)l件下，納米金-硒修飾的多肽探針不僅具有很高的熱穩(wěn)定性，并且在測定MMP-2活性時(shí)呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗谷胱甘肽干擾的能力。

2.5 檢測MMPs的響應(yīng)型BRET多肽探針構(gòu)建機(jī)制及 應(yīng)用

與FRET系統(tǒng)的構(gòu)建機(jī)理相似，BRET探針的構(gòu)建由MMPs活性肽鏈連接生物發(fā)光供體和熒光蛋白受體。BRET探針在測定酶活性的過程中無需背景的消除，相比FRET具有較低的背景干擾和檢測靈敏度。

Wang等[44]設(shè)計(jì)了一種檢測MMP-13的BRET探針，以海腎的熒光素酶突變體（Rluc8）為生物發(fā)光供體，以黃色熒光蛋白為受體，供體和受體可通過MMP-13特異性識(shí)別的多肽底物片段連接。當(dāng)MMP-13特異性識(shí)別降解多肽鏈，使BRET系統(tǒng)被破壞并產(chǎn)生熒光信號(hào)變化，根據(jù)熒光信號(hào)變化情況可以計(jì)算出MMP-13的活性和表達(dá)水平。

得益于BRET方法在不破壞細(xì)胞的情況下可以監(jiān)測蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）的特性，BRET方法已作為研究活細(xì)胞中分子相互作用的通用技術(shù)之一。BRET分析已用于研究許多跨膜型受體，包括G蛋白偶聯(lián)受體[45]。

近年來，通過將該分析方法與多種檢測設(shè)備（例如發(fā)光板讀取器、生物發(fā)光顯微鏡和小型動(dòng)物光學(xué)成像平臺(tái)）聯(lián)用，大大提高了BRET的適用性。

3 結(jié)語和展望

與核酸和蛋白質(zhì)相比，基于多肽的檢測探針化學(xué)合成簡便、容易標(biāo)記。隨著新型熒光劑、新型多肽片段和新型材料的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展，必將產(chǎn)生更多新型多肽探針，對(duì)蛋白質(zhì)的體內(nèi)體外檢測將起到很大的推動(dòng)作用。已有研究設(shè)計(jì)、篩選、合成、優(yōu)化了多種MMP-2/9的響應(yīng)型多肽探針，在腫瘤內(nèi)MMPs檢測以及腫瘤的早期診斷當(dāng)中取得了初步成功，具有普遍性和實(shí)用性，可以作為其他蛋白酶類多肽探針的開發(fā)平臺(tái)的參考。然而MMP-2/9的響應(yīng)型多肽探針的開發(fā)仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如MMP-2/9的特異性多肽片段難發(fā)現(xiàn)、腫瘤微環(huán)境中MMP-2/9與探針結(jié)合不穩(wěn)定等。此外，MMP-2/9響應(yīng)型多肽探針的設(shè)計(jì)和制作成本仍較高，以及探針的回收和固定化也需在其應(yīng)用于臨床檢測之前解決。鑒于MMP-2/9的響應(yīng)型多肽探針在疾病檢測方面的廣闊應(yīng)用前景，設(shè)計(jì)和開發(fā)響應(yīng)性強(qiáng)、生物兼容性好的生物成像和檢測探針對(duì)腫瘤及其他疾病的預(yù)防、診斷和治療意義重大。