孔凡華，徐佳佳，郭倩，白沙沙，李東，方從容，邱楠楠*，崔亞娟*

1(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100021) 2(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京，100069)

蝦青素為萜烯類不飽和化合物，化學(xué)名稱是3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，是一種具有超級(jí)抗氧化活性的類胡蘿卜素[1]，其抗氧化性能是維生素E、維生素C、β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質(zhì)的幾十倍甚至幾百倍[2-4]。雨生紅球藻、紅法夫酵母、南極磷蝦、一些浮游生物、藻類、螃蟹外殼、河螯蝦外殼、牡蠣、三文魚(yú)皮、鮭魚(yú)等動(dòng)物中含有蝦青素。蝦青素具有多種生物功能，它能終止生物系統(tǒng)中炎癥的發(fā)生[5]、對(duì)抗自由基損傷以維持免疫系統(tǒng)防御[6]、降低心臟病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[7]、減輕神經(jīng)退行性疾病帶來(lái)的影響[8]、抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)[9]及對(duì)抗紫外線引起的光氧化損傷[10]等。

蝦青素具有較長(zhǎng)的共軛雙鍵鏈，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，存在多種同分異構(gòu)體，蝦青素及其異構(gòu)體的定性定量分析是結(jié)構(gòu)解析和功能研究的基礎(chǔ)。天然蝦青素大多與脂肪酸結(jié)合，以酯化的形態(tài)存在，但由于缺乏蝦青素酯標(biāo)準(zhǔn)品，且人工合成蝦青素酯困難，限制了蝦青素酯的定性定量研究。蝦青素酯脫去脂肪酸鏈后可以形成游離的蝦青素，包括全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素等，使蝦青素的定量研究變得容易操作[11]。目前，蝦青素脫脂的主要方法是堿性皂化和酶解方法，堿性皂化脫脂會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物并引起蝦青素降解[12]，食品化學(xué)法典(FCC)(2012)[13]采用來(lái)自假單胞桿菌的膽固醇酯酶(EC 3.1.1.13)進(jìn)行蝦青素酯的酶解，可以使蝦青素酯水解完全。色譜技術(shù)的發(fā)展在蝦青素的定性定量分析上起了非常重要的作用，隨著紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜法、紅外光譜、拉曼光譜和圓二色光譜的快速發(fā)展，蝦青素的結(jié)構(gòu)鑒定變得更為簡(jiǎn)單容易，考慮到設(shè)備的成本，樣品制備的復(fù)雜程度和方法的局限性，蝦青素的定量分析方法主要是分光光度法和高效液相色譜法。分光光度法具有快速簡(jiǎn)單、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是只能對(duì)蝦青素總量進(jìn)行估算，無(wú)法對(duì)其中蝦青素的存在形式進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。高效液相色譜法分離效果好、靈敏度高、選擇性好成為目前測(cè)定蝦青素的常用方法。我國(guó)測(cè)定蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)方法有《紅球藻中蝦青素的測(cè)定 液相色譜法》(GB/T 31520—2015)[14]適用于雨生紅球藻藻粉中蝦青素含量的測(cè)定；《水產(chǎn)品及其制品中蝦青素含量的測(cè)定 高效液相色譜法》(SC/T 3053—2019)[15]適用于魚(yú)類、甲殼類及蝦粉、磷蝦油等制品中蝦青索含量的測(cè)定；《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中角黃素、蝦青素的檢測(cè)方法》(SN/T 2327—2009)[16]適用于黃魚(yú)、鰻魚(yú)、雞肉、雞蛋、鴨肝、豬腎和牛奶中角黃素、蝦青素的測(cè)定與確證；《植物提取物 蝦青素油》(T/CCCMHPIE 1.23—2016)[17]適用于以人工培養(yǎng)的紅球藻屬雨生紅球藻為原料經(jīng)提取精制后，得到的蝦青素油中蝦青素的測(cè)定。以上標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)有機(jī)溶劑直接提取或者堿性皂化脫脂后提取蝦青素，容易引起蝦青素的降解[12]，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確或?qū)y(cè)定結(jié)果造成干擾；標(biāo)準(zhǔn)方法多采用三相洗脫系統(tǒng)分離蝦青素及其異構(gòu)體，對(duì)液相系統(tǒng)要求高。本文參照蝦青素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[14-17]和文獻(xiàn)方法[13，18-23]，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)提取試劑、膽固醇酯酶酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以蝦青素含量的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取試劑和酶解條件；通過(guò)比較色譜柱、流動(dòng)相等高效液相色譜條件，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度和峰形對(duì)稱性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳色譜條件，實(shí)現(xiàn)蝦青素油中蝦青素的有效提取和高效分離。以蝦青素油為研究對(duì)象，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和適用性，并比較實(shí)驗(yàn)建立的酶解方法與文獻(xiàn)中的堿性皂化方法[18]對(duì)蝦青素油中蝦青素的提取效率，以期建立蝦青素油中蝦青素的精準(zhǔn)分析檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超臨界二氧化碳萃取的雨生紅球藻蝦青素油，市購(gòu)；全反式蝦青素對(duì)照品(純度96.9%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH；9-順-蝦青素、13-順-蝦青素對(duì)照品(純度≥95.0%)，Sigma公司；膽固醇酯酶16.3 U/mg，月旭科技股份有限公司。

甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(均為色譜純)，美國(guó)Fisher公司；無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸(分析純),北京化工廠；石油醚(分析純),福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；丙酮(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純),浙江聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S分析天平,德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；METTLER TOLEDO pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；QL-901斡旋振蕩器,海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超市儀器有限公司；HITACHI CF16RXII 高速冷凍離心機(jī),日本日立科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器和ChemStation for LC systems色譜工作站,美國(guó)Agilent公司；YMCTMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

(1)0.021 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液：稱取0.084 g氫氧化鈉，加入80 mL 甲醇溶解并定容到100 mL。

(2)0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7)：準(zhǔn)確稱取3.028 5 g Tris，加入450 mL去離子水溶解后，用0.5 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，然后用去離子水定容至500 mL。

(3)膽固醇酯酶溶液：稱取6.2 mg膽固醇酯酶于25 mL容量瓶中，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液定容至刻度，膽固醇酯酶溶液濃度約為4 U/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(4)全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，加丙酮溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為40 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(5)全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用丙酮稀釋成各濃度均為0.80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于定性，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(6)全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用丙酮稀釋成濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、4.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 色譜條件的選擇

孫偉紅等[19]研究表明，C30色譜柱對(duì)蝦青素異構(gòu)體的分離效果和響應(yīng)值優(yōu)于C18色譜柱，更有利于定量結(jié)果的分析，所以本實(shí)驗(yàn)選擇YMCTMC30色譜柱。參考標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)方法，選擇甲基叔丁基醚-乙腈(體積比95∶5)[20]、甲醇-甲基叔丁基醚-水(體積比83∶15∶2)[21]、水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(體積比4.5∶28∶22∶45.5)[22]、水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(5∶85∶5∶5)[23]和甲醇-甲基叔丁基醚[24]等流動(dòng)相體系洗脫，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素分離的色譜條件。

1.3.3 提取溶劑的選擇

蝦青素油用丙酮稀釋500倍作為實(shí)驗(yàn)用蝦青素油樣品。實(shí)驗(yàn)參照食品化學(xué)法典FCCth(2012)[23]的方法，并加以改進(jìn)。稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，樣品稱取15份，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=7)和1 mL膽固醇酯酶(4 U/mL)溶液振蕩均勻后，在37 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)振蕩酶解60 min，取出立即冷卻至室溫。向每份酶解液中分別加入 2.0 mL石油醚、二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)、丙酮、乙腈、甲醇-乙酸乙酯-石油醚(體積比1∶1∶1)，每種提取溶劑做3個(gè)平行，每份樣品均加入1 g無(wú)水硫酸鈉后在渦旋振蕩器上渦旋提取2 min，靜置分層后，分別將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，重復(fù)提取2次，合并提取液于容量瓶中，氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇定容至刻度，溶液過(guò)0.45 μm有機(jī)系濾膜后，待測(cè)定。

1.3.4 酶解時(shí)間的選擇

稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=7)和1.0 mL膽固醇酯酶(4 U/mL)溶液振蕩均勻后，在37 ℃ 恒溫水浴振蕩器內(nèi)分別振蕩酶解15、30、45、60、75、90、120 min，取出立即冷卻至室溫，用石油醚提取，其他操作步驟同1.3.3。

1.3.5 方法驗(yàn)證

按照GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[25]方法學(xué)要求，建立校準(zhǔn)曲線及校準(zhǔn)曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機(jī)測(cè)定，R(S/N)=3時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限，R(S/N)=10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限；稱取蝦青素油樣品，按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法，平行測(cè)定6次，計(jì)算蝦青素的含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重現(xiàn)性；根據(jù)蝦青素油樣品中蝦青素的含量，按本底值的0.5倍、1倍、1.5倍3個(gè)濃度水平，進(jìn)行3水平6平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以回收率的高低評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。

1.3.6 堿性皂化脫脂方法

參見(jiàn)YUAN等[18]和蘇芳[26]的方法，稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，加入5 mL 0.021 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液，5 ℃水浴中避光皂化60 min，加入 2 mL 純凈水和 2 mL 石油醚，在渦旋振蕩器上振蕩2 min，靜置分層后，將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，重復(fù)提取2次至石油醚層無(wú)色，合并提取液于容量瓶中，氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇定容至刻度，溶液過(guò)0.45 μm有機(jī)系濾膜后，測(cè)定。

1.4 蝦青素含量的計(jì)算

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將各濃度全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，9-順式蝦青素和13-順式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)蝦青素異構(gòu)體組分的保留時(shí)間定性。選定峰面積相近的全反式蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)工作液多點(diǎn)校準(zhǔn)定量，試樣測(cè)定結(jié)果以3種蝦青素同分異構(gòu)體的總和計(jì)，外標(biāo)法定量，同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。

1.4.2 結(jié)果計(jì)算

試樣中蝦青素的含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：X,試樣中蝦青素的含量，%；1.3,13順-蝦青素對(duì)全反式蝦青素的校正因子；A13-cis,試樣溶液中13-順-蝦青素的峰面積；Atras,試樣溶液中全反式蝦青素的峰面積；1.1,9-順-蝦青素對(duì)全反式蝦青素的校正因子；A9-cis,試樣溶液中9-順-蝦青素的峰面積；Cs,標(biāo)準(zhǔn)工作液中全反式蝦青素的含量，μg/mL；V,試樣溶液體積，mL；As,標(biāo)準(zhǔn)工作液中全反式蝦青素的峰面積；m,試樣質(zhì)量，mg；f,稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的 ChemStation for LC systems工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

數(shù)據(jù)的差異性分析在SPSS軟件上進(jìn)行，P<0.05時(shí)，說(shuō)明差異水平顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

不同流動(dòng)相體系對(duì)全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素分離效果見(jiàn)表1。

目前，多采用三相洗脫系統(tǒng)[14-15,17,19,27]或者正相洗脫系統(tǒng)[26]分離蝦青素及其異構(gòu)體，對(duì)液相系統(tǒng)要求較高，且普適性較差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化液相色譜條件，采用甲醇-甲基叔丁基醚兩相梯度洗脫，可以實(shí)現(xiàn)3種蝦青素異構(gòu)體的有效分離，結(jié)果如圖1所示，優(yōu)化得到分離蝦青素的色譜條件為：

色譜柱：YMCTMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：472 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 色譜條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of chromatographic conditions

圖1 全反式蝦青素、9-順式蝦青素、13-順式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin

2.2 提取溶劑的選擇

室溫條件下，蝦青素在丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜、乙醇及其他非極性溶劑中的溶解性較好[28]。本試驗(yàn)根據(jù)前人研究基礎(chǔ)，選取5種不同提取溶劑，比較不同提取溶劑對(duì)蝦青素油中蝦青素的提取得率，結(jié)果顯示，石油醚對(duì)蝦青素的提取效果最佳，顯著高于其他提取溶劑(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2，蝦青素油中蝦青素異構(gòu)體的HPLC色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 不同提取溶劑的提取結(jié)果(n=3)Table 2 Results of different extraction solvents(n=3)

圖2 蝦青素油脂中全反式蝦青素、9-順式蝦青素、13-順式蝦青素液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin in astaxanthin oil

2.3 酶解時(shí)間的選擇

膽固醇酯酶的酶解時(shí)間影響蝦青素酯的酶解效果，酶解時(shí)間不足，會(huì)導(dǎo)致酶解不完全，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成蝦青素的降解，不同酶解時(shí)間提取結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同酶解時(shí)間的提取結(jié)果(n=3)Table 1 Results of different enzymolysis time(n=3)

由表3知，在37 ℃條件下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素的含量增加， 60 min時(shí)酶解完全，蝦青素含量為92.9%，繼續(xù)酶解到75 min和90 min，蝦青素含量分別為90.6%和91.0%，與60 min時(shí)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，酶解120 min，蝦青素含量明顯降低(P<0.05)，其原因可能是溫度對(duì)蝦青素的降解破壞作用導(dǎo)致，因此酶解時(shí)間需要嚴(yán)格控制，以避免蝦青素的損失，以4 U/mL 膽固醇酯酶37 ℃條件下酶解60 min最佳。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

按照1.3.3操作，在2.1色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，得到全反式蝦青素為0.10～4.00 μg/mL，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，蝦青素的檢出限為0.1 mg/g，定量限為0.3 mg/g。

2.4.2 方法精密度實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的前處理方法和色譜條件，平行測(cè)定6次，蝦青素油中蝦青素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.36%，表明精密度高，適合蝦青素的定量分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方法精密度結(jié)果(n=6)Table 4 Results of precision(n=6)

2.4.3 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確度為分析方法測(cè)定的平均值與真值相符的程度。穩(wěn)定樣品中加入不同水平已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量作為真值)稱加標(biāo)樣品；同時(shí)測(cè)定蝦青素油和蝦青素油加標(biāo)樣品；加標(biāo)樣品扣除樣品值后與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的誤差即為該方法的準(zhǔn)確度，按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：P,加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率；m,加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，μg；X1,加標(biāo)試樣的測(cè)定值，μg；X0,未加標(biāo)試樣的測(cè)定值，μg。采用樣品加標(biāo)試驗(yàn)進(jìn)行本方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 Results of recovery rate of ginger(n=6)

由表5可知，蝦青素油中蝦青素的回收率為90.39%～98.48%，平均回收率為93.58%，RSD為2.84%，表明方法添加回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，適合蝦青素含量的測(cè)定。

2.5 不同脫脂方法測(cè)得蝦青素的含量

比較實(shí)驗(yàn)建立的膽固醇酯酶酶解方法、堿性皂化方法對(duì)蝦青素油中蝦青素的提取效率，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同脫脂方法測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 6 Results of different degreasing methods(n=3)

由表6可知，膽固醇酯酶酶解所得蝦青素含量是92.9%，顯著高于苗鳳萍[29]報(bào)道的72.04%和ZHAO等[12]報(bào)道的63.2%，與蘇芳[26]報(bào)道的92.95%結(jié)果相近。酶解所得蝦青素含量是堿性皂化得率的2.11倍，這可能是因?yàn)閴A不僅對(duì)脂肪酸有破壞作用，對(duì)蝦青素也有很大的降解作用，而膽固醇酯酶對(duì)脂肪酸有特異性，可以減少對(duì)蝦青素的降解。張麗瑤等[30]研究表明蝦青素溶液經(jīng)超聲處理后，全反式異構(gòu)體的濃度大幅度降低，9-順式和13-順式異構(gòu)體濃度均有所增加，超聲處理使蝦青素降解為其他成分。對(duì)比蝦青素的得率，可見(jiàn)，酶解法對(duì)蝦青素的含量影響較小，先酶解再進(jìn)行高效液相色譜分析是對(duì)含蝦青素酯樣品的含量及幾何異構(gòu)體測(cè)定的可靠方法，可以準(zhǔn)確定量樣品中蝦青素的含量。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)提取試劑、膽固醇酯酶酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以蝦青素得率高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到蝦青素油中蝦青素的最佳提取條件為37 ℃恒溫水浴振蕩酶解60 min，石油醚提取，該方法對(duì)蝦青素油中蝦青素的提取得率為92.9%，是堿性皂化得率的2.11倍。通過(guò)比較色譜柱、流動(dòng)相等高效液相色譜條件，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度和峰形對(duì)稱性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳色譜條件為YMCTMC30色譜柱，甲醇-甲基叔丁基醚兩相梯度洗脫，可以實(shí)現(xiàn)3種蝦青素異構(gòu)體的有效分離，相比于目前常用的三相洗脫程序和正相洗脫系統(tǒng)，要求的液相系統(tǒng)簡(jiǎn)單。選擇蝦青素油進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，全反式蝦青素在0.10～4.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系；蝦青素的檢出限為0.1 mg/g，定量限為0.3 mg/g；按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳酶解方式和色譜條件，平行測(cè)定6次，蝦青素油中蝦青素含量的RSD為1.36%，表明精密度高；按蝦青素油樣品中蝦青素含量的0.5倍、1倍、1.5倍3個(gè)濃度水平，進(jìn)行3水平6平 行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到蝦青素油中蝦青素的回收率為90.39%～98.48%，平均回收率為93.58%，RSD為2.84%，表明添加回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，實(shí)驗(yàn)建立的方法適合蝦青素油樣品中蝦青素含量的測(cè)定。