于文皓, 于 洋, 王雯丹, 李依彤, 司徒文佑, 靳 艷*

(1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院分離分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 2. 北京伊利科技發(fā)展有限責(zé)任公司, 北京 100070)

人乳是嬰兒最早的食物,不僅為嬰兒提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng),而且為人類(lèi)提供構(gòu)建最初免疫系統(tǒng)的活性因子。蛋白質(zhì)是人乳中最重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一,大部分蛋白質(zhì)隨乳汁分泌后被嬰兒食用并消化吸收,但是還有部分蛋白質(zhì)在乳腺中就被乳汁中的蛋白酶降解并泌出體外,形成了人乳的重要組分內(nèi)源肽。人乳內(nèi)源肽與嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),母親自身機(jī)能可根據(jù)嬰兒健康調(diào)節(jié)內(nèi)源肽的產(chǎn)生[1],早產(chǎn)兒的自身消化系統(tǒng)還不完善不能消化大量蛋白質(zhì),需要更多內(nèi)源肽滿足早產(chǎn)兒的營(yíng)養(yǎng)需求,因此肽的濃度和豐度等指標(biāo)在早產(chǎn)的人乳樣品中顯著高于足月產(chǎn)的人乳樣品[2]。對(duì)人乳內(nèi)源肽功能研究發(fā)現(xiàn),人乳內(nèi)源肽具有抗菌[3,4]、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)腸道菌群[5]等多種生理功能[6],這些功能對(duì)于嬰兒免疫系統(tǒng)建立具有重要作用。因此,研究人乳內(nèi)源肽對(duì)于嬰兒的健康、成長(zhǎng)發(fā)育以及嬰兒配方奶粉的研發(fā)具有重要意義。

基于LC-MS/MS的肽組學(xué)技術(shù)具有高效、高靈敏度的特點(diǎn),在對(duì)人體血清[7,8]、唾液[9]等組織的肽組學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,肽組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也使得人乳內(nèi)源肽的研究取得突破性進(jìn)展[10]。Dallas等[2]利用肽組學(xué)技術(shù)揭示了人乳內(nèi)源肽在乳腺內(nèi)形成的機(jī)制。Holton等[11]利用肽組學(xué)技術(shù)研究人乳內(nèi)源肽在消化過(guò)程中的變化。Gan等[12]利用肽組學(xué)技術(shù)研究了pH對(duì)人乳中蛋白質(zhì)和蛋白酶體系的影響。肽組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用揭示了人乳內(nèi)源肽的產(chǎn)生、消化過(guò)程以及與嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。但是內(nèi)源肽在人乳中的含量非常低,高豐度蛋白質(zhì)及其他成分干擾內(nèi)源肽的分析檢測(cè),因此內(nèi)源肽的分離制備是研究人乳內(nèi)源肽必不可少的關(guān)鍵步驟。目前常用的肽制備方法有三氯乙酸(trichloroacetic acid solution, TCA)沉淀法[2]、離心超濾法[13,14]、有機(jī)溶劑沉淀法[15-17],以及利用強(qiáng)疏水性碳介孔材料(highly ordered mesoporous carbon, OMC)富集法[18]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的人乳內(nèi)源肽研究中大多采用TCA沉淀法制備內(nèi)源肽[12,19],因此關(guān)于樣品制備方法對(duì)于人乳內(nèi)源肽分析結(jié)果影響的研究非常少見(jiàn)[20]。為了比較不同制備方法對(duì)人乳內(nèi)源肽的影響,本研究分別采用不變性、加熱變性和化學(xué)變性后超濾的超濾法、有機(jī)溶劑沉淀和酸沉淀的沉淀法以及OMC材料富集法共6種方法制備人乳內(nèi)源肽,利用LC-MS/MS研究樣品制備方法對(duì)人乳內(nèi)源肽分析結(jié)果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料、試劑與樣品

LC-MS/MS系統(tǒng)由Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)和LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀(配有納升電噴霧離子源及Xcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))組成。SpeedVac真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)Thermo公司。Milli-Q超純水一體機(jī)和超濾管(10 kDa, 0.5 mL)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman公司。

石英毛細(xì)管購(gòu)自美國(guó)Polymicro Technologies公司。Waters Oasis HLB固相萃取小柱購(gòu)自美國(guó)Waters公司。OMC材料為中國(guó)科學(xué)院分離分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

甲酸(formic acid, FA,色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fluka公司;乙腈(acetonitrile, ACN,色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司。甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、三氯乙酸(trichloroacetic acid solution, TCA)、脲、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。其他有機(jī)溶劑購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

人乳樣品由北京伊利科技發(fā)展有限責(zé)任公司提供,樣品采自45位居住于哈爾濱、青島、呼和浩特3個(gè)城市分娩后3～17天的母親,乳母年齡為23～39周歲。樣品采集后冷凍于-80 ℃,本研究所使用的樣品是45份樣品的混合物。

1.2 人乳內(nèi)源肽的制備方法

采用了超濾法、沉淀法和OMC材料富集法3種方法制備人乳內(nèi)源肽。超濾法中分別考察了不變性(UF 1)、熱變性(UF 2)和化學(xué)變性(UF 3)3種變性方式對(duì)內(nèi)源肽的影響;沉淀法中分別考察了酸沉淀(PCPN 1)和有機(jī)溶劑沉淀(PCPN 2)兩種沉淀方式的影響。內(nèi)源肽制備方法和編號(hào)見(jiàn)表1。

表 1 人乳內(nèi)源肽的制備方法

1.2.1超濾法

不變性:取200 μL人乳用去離子水稀釋5倍混合均勻。熱變性:參考Wang等[7]的方法,取200 μL人乳用去離子水稀釋5倍混合均勻,稀釋液在水浴95 ℃變性5 min。化學(xué)變性:參考Wan等[21]的方法,取200 μL人乳加入800 μL蛋白質(zhì)變性液(7 mol/L脲、2 mol/L硫脲、20 mmol/L DTT),混合均勻變性30 min。不變性、熱變性和化學(xué)變性后的樣品分別用截留相對(duì)分子質(zhì)量10 kDa的超濾管在14 000 g、20 ℃條件下超濾30 min,收集超濾液分別得到UF 1、UF 2和UF 3法制備的樣品,超濾液冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.2沉淀法

酸沉淀法:參考Dallas等的方法[2,22],取200 μL人乳與200 g/L TCA以體積比1∶1混合,充分混勻后在14 000 g、4 ℃條件下離心20 min,收集上清液為PCPN 1樣品。有機(jī)溶劑沉淀法:取200 μL人乳與800 μL有機(jī)溶劑(50%乙醇+50%丙酮+0.1%醋酸)混合,充分混勻后于-20 ℃過(guò)夜沉淀,在14 000 g、4 ℃條件下離心20 min,收集上清液為PCPN 2樣品。酸沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法獲得的上清液冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.3OMC富集法

取20 μL人乳,加入120 μL 0.1%(v/v)TFA水溶液,95 ℃保溫5 min后加入30 μL質(zhì)量濃度為30 g/L的OMC材料,振蕩孵育30 min,在20 000 g、20 ℃離心3 min,棄去上清液,加入100 μL 0.1%(v/v) TFA水溶液混勻后離心棄去上清液,以上操作重復(fù)兩次。加入100 μL 80%(v/v)ACN/0.1%(v/v)TFA水溶液混勻后離心收集上清液,以上操作重復(fù)兩次,合并收集到的上清液,即為OMC樣品,冷凍干燥后用于后續(xù)處理。

1.3 樣品脫鹽處理

經(jīng)過(guò)1.2節(jié)不同方法處理的樣品分別用SPE柱除鹽,步驟如下:SPE柱用1.5 mL甲醇活化后加入1.5 mL 0.1%(v/v)TFA水溶液平衡,將樣品以0.5 mL 0.1%(v/v) TFA水溶液溶解后加入SPE柱中,以1.5 mL 80%(v/v) ACN/0.1%(v/v) TFA-H2O溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液冷凍干燥保存于-80 ℃。

1.4 LC-MS/MS分析

脫鹽后的樣品以0.1%(v/v)甲酸水溶液溶解并制備成質(zhì)量濃度為0.2 g/L的溶液,上樣量為8 μL,加載到15 cm毛細(xì)管分析柱(內(nèi)徑為180 μm,填充C18AQ填料)中進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液,流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的98%乙腈溶液。梯度洗脫程序如下:0～80 min, 5%B～25%B; 80～95 min, 25%B～35%B; 95～97 min, 35%B～90%B; 97～107 min, 90%B; 107～109 min, 90%B～0%B; 109～126 min, 0%B;流速70 μL/min。在Orbitrap質(zhì)量分析儀中以60 000的分辨率獲得了完整的質(zhì)譜掃描圖(m/z400～2 000)。對(duì)其中最強(qiáng)的15個(gè)離子進(jìn)行離子碰撞解離(CID),再進(jìn)行MS/MS掃描,掃描范圍在m/z400～2 000。動(dòng)態(tài)排除功能設(shè)置如下:重復(fù)2;持續(xù)時(shí)間30 s;排除持續(xù)時(shí)間為60 s。系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集由Xcalibur軟件進(jìn)行。每個(gè)樣品進(jìn)行3次質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)檢索

Xcalibur采集的*. RAW文件用Thermo Proteome Discoverer (v1.4)轉(zhuǎn)換成*. MGF格式,之后用Mascot 2.5.1軟件在人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Human spains,蛋白質(zhì)數(shù)目為22 427, http://www.uniprot.org/)中進(jìn)行檢索。搜庫(kù)參數(shù)如下:不設(shè)置酶切、最大漏切數(shù)和固定修飾,可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸的氧化(+15.994 9 Da)。母離子的質(zhì)量容忍偏差為20 ppm,碎片離子為0.8 Da。導(dǎo)出肽段時(shí)控制假陽(yáng)性率(FDR)<1%,對(duì)導(dǎo)出結(jié)果Score > 20的肽段視為有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS分析內(nèi)源肽的基峰色譜圖

將人乳樣品分別經(jīng)過(guò)表1所列的方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析,圖1為在相同分析條件下不同方法制備的人乳內(nèi)源肽的基峰色譜圖。UF 1、UF 2、UF 3與OMC法制備的樣品的色譜峰在10～100 min的時(shí)間內(nèi)均有分布,說(shuō)明超濾法和OMC法制備的樣品中肽段極性較寬泛。經(jīng)PCPN 1和PCPN 2兩種沉淀法制備的樣品顯示出較大差別,其中PCPN 1法制備的樣品譜峰主要集中在10～70 min,說(shuō)明該樣品中親水性肽較多;PCPN 2法制備的樣品的譜峰主要集中在50～100 min,說(shuō)明該樣品中疏水性肽段較多。

圖 1 不同方法制備的人乳內(nèi)源肽的LC-MS/MS基峰色譜圖

2.2 不同方法制備的人乳內(nèi)源肽及其母體蛋白質(zhì)

每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn),在3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中均被鑒定到的肽視為共有肽段;3次結(jié)果鑒定到的所有肽段合并刪除重復(fù)肽段后得到的肽段為該方法的總肽段鑒定結(jié)果;共有肽段數(shù)占總肽段數(shù)的百分比為共有肽段百分比。母體蛋白質(zhì)為釋放內(nèi)源肽的蛋白質(zhì),其數(shù)據(jù)處理與肽的處理方法一致。

表 2 LC-MS/MS鑒定的不同方法制備的人乳內(nèi)源肽及其母體蛋白質(zhì)數(shù)目(n=3)

不同方法制備的樣品經(jīng)LC-MS/MS分析,所鑒定到的肽及其母體蛋白質(zhì)的數(shù)目結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),不同方法制備的樣品中所能鑒定到的肽段數(shù)目存在很大差別,其中UF 1法和UF 2法制備的樣品鑒定到的肽段數(shù)目最多,分別為1 161±8條和1 017±91條;化學(xué)變性法UF 3鑒定的肽段數(shù)目最少,只有366±18條。兩種沉淀法PCPN 1和PCPN 2鑒定的肽段數(shù)目非常接近,分別為779±69和876±55條。OMC法制備的樣品中鑒定到的肽段數(shù)目為549±151條。樣品中鑒定的內(nèi)源肽的母體蛋白質(zhì)數(shù)目與內(nèi)源肽數(shù)目表現(xiàn)出類(lèi)似的規(guī)律。

共有肽段百分比和肽段數(shù)目的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)反映了樣品數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。UF 1法制備的樣品中共有肽段百分比最高為51.49%, OMC法制備的樣品中共有肽段百分比最低僅為31.82%,其他4種方法制備的樣品百分比比較接近,為38.48%～44.28%。同一樣品3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中肽段數(shù)目的RSD順序依次為:UF 1法制備的樣品中鑒定到肽段數(shù)目的RSD最低為0.65%, OMC法制備的樣品中鑒定到肽段數(shù)目的RSD最高為27.55%,其他3種方法制備的樣品中鑒定到肽段數(shù)目的RSD均小于10%。每種樣品中鑒定到的母體蛋白質(zhì)中共有蛋白質(zhì)的百分比與共有肽段的百分比顯示出相似的變化規(guī)律。

以上結(jié)果說(shuō)明,UF 1法制備的樣品所能鑒定到肽段數(shù)目最多,數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性最好;UF 2法制備的樣品所能鑒定到的肽段數(shù)目與UF 1法制備的樣品的數(shù)目最接近,但穩(wěn)定性較差;UF 3法制備的樣品所能鑒定到的肽段數(shù)目最少;PCPN 1法制備的樣品和PCPN 2法制備的樣品所能鑒定到的肽段數(shù)目和數(shù)據(jù)穩(wěn)定性都接近;OMC法制備的樣品的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性最差。目前人乳內(nèi)源肽組學(xué)研究的文獻(xiàn)中[2,22,23]常采用PCPN 1方法制備的內(nèi)源肽,從以上結(jié)果來(lái)看該方法制備的樣品在鑒定肽段數(shù)目、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性等方面均不占優(yōu)勢(shì)。

2.3 不同方法制備的人乳內(nèi)源肽的性質(zhì)

將LC-MS/MS鑒定到的內(nèi)源肽的長(zhǎng)度、等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)及親水性平均系數(shù)(grand average of hydropathicity, GRAVY)等性質(zhì)進(jìn)行計(jì)算,不同性質(zhì)的肽段占比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖2。6種方法制備的樣品所鑒定到的肽的氨基酸數(shù)目為6～45,其中11～20個(gè)氨基酸的肽占比最大,其次是21～30個(gè)氨基酸的肽和氨基酸數(shù)≤10個(gè)的肽,不同方法制備的肽在氨基酸數(shù)目分布方面沒(méi)有明顯差別。6種方法制備的人乳內(nèi)源肽的等電點(diǎn)范圍為2.00～13.00,除了OMC法外其他5種方法制備的樣品的肽的等電點(diǎn)分布非常類(lèi)似,即pI為4.01～5.00的肽占比最大。而OMC法制備的肽在不同pI間的百分比非常接近,說(shuō)明OMC法富集內(nèi)源肽時(shí)對(duì)pI沒(méi)有偏倚。6種方法制備的肽的GRAVY在-3.00～2.00的范圍,所有的樣品中GRAVY在-0.99～0.00內(nèi)的肽占比都最大,6種方法制備的樣品中GRAVY為0.01～1的肽占比OMC法最高。以上結(jié)果說(shuō)明,除OMC法外其他5種方法制備的人乳內(nèi)源肽的物理性質(zhì)差別不大,OMC法制備的人乳內(nèi)源肽的pI和GRAVY均顯示與其他5種方法存在差別,說(shuō)明OMC法制備的樣品結(jié)果顯示一定的特異性。

圖 2 不同方法制備的人乳內(nèi)源肽的性質(zhì)

圖 3 不同方法制備的樣品中鑒定到的肽段的個(gè)數(shù)及頻次

2.4 不同方法制備的人乳內(nèi)源肽的差異

為了比較不同方法制備的樣品中所鑒定到的肽段的差異,對(duì)同一肽段在不同樣品中鑒定到的次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中的6個(gè)色塊分別代表同一肽段在6種方法制備的樣品被鑒定的次數(shù),例如6表示同一個(gè)肽段在6個(gè)樣品中均被鑒定到,5表示同一肽段在5個(gè)樣品中鑒定到,以此類(lèi)推。6個(gè)樣品中都能鑒定到的共有肽段有205條,分別是來(lái)源于β-酪蛋白的171條、αs1-酪蛋白的14條、免疫球蛋白受體的9條、骨橋蛋白的6條和κ-酪蛋白的5條。共有肽段數(shù)占各樣品總肽段數(shù)的百分比分別為13%(UF 1)、14%(UF 2)、39%(UF 3)、19%(PCPN 1)、17%(PCPN 2)和23%(OMC)。雖然UF 3法和OMC法制備的樣品中鑒定到的總肽段數(shù)目較少,但共有肽段占比較高。圖3中1表示某個(gè)樣品中所能鑒定到的獨(dú)有肽段,6個(gè)樣品獨(dú)有肽段占比在11%～16%的范圍內(nèi),UF 1法和UF 2法制備的樣品中鑒定到的獨(dú)有肽段數(shù)目最多分別為226和228條。UF 1和UF 2制備的樣品中不僅肽的總數(shù)最高而且獨(dú)有肽段數(shù)目最多。

為了比較不變性、熱變性和化學(xué)變性對(duì)超濾結(jié)果的影響,UF 1、UF 2和UF 3法制備的樣品中鑒定到的總肽段結(jié)果的維恩圖見(jiàn)圖4a。3種超濾樣品的共有肽段數(shù)目占其總肽段數(shù)目的百分比分別為68%、71%和83%,說(shuō)明3種方法均能鑒定到人乳中大部分的內(nèi)源肽,雖然化學(xué)變性的UF 3能鑒定到的肽段數(shù)目少,但該樣品中83%的肽和另外兩個(gè)樣品中鑒定到的相同。UF 1和UF 2中所鑒定到的肽段的數(shù)目接近,兩種方法制備的樣品中共有肽段分別占其鑒定肽段的百分比為70%和73%,說(shuō)明兩種方法制備的肽非常接近,變性與否對(duì)所制備的肽影響不大,這個(gè)結(jié)果與Dallas證明不變性和熱變性對(duì)三氯乙酸沉淀制備人乳內(nèi)源肽沒(méi)有影響的結(jié)論一致[22]。兩種沉淀法PCPN 1和PCPN 2制備的樣品的總肽段數(shù)目的維恩圖見(jiàn)圖4b,兩種方法共有肽段數(shù)目占其總肽段數(shù)目的百分比分別是54%和49%,說(shuō)明不同沉淀方法所制備的人乳內(nèi)源肽差異較大。

圖 4 (a)超濾法和(b)沉淀法制備的樣品中人乳內(nèi)源肽的維恩圖

2.5 人乳內(nèi)源肽的母體蛋白質(zhì)

不同方法制備的樣品中釋放內(nèi)源肽數(shù)目最多的前十個(gè)母體蛋白質(zhì)列于圖5。6種方法制備的樣品中均能鑒定到的母體蛋白質(zhì)有:β-酪蛋白,免疫球蛋白受體、骨橋蛋白、αS1-酪蛋白、κ-酪蛋白和膽鹽激活脂肪酶,來(lái)源于共有的母體蛋白質(zhì)的肽段數(shù)目在該樣品中占比均超過(guò)88%,說(shuō)明6種方法制備的樣品都可以滿足鑒定一般人乳內(nèi)源性多肽的要求。

乳鐵蛋白是人乳中重要的糖蛋白,對(duì)于嬰兒胃腸系統(tǒng)具有重要的作用,已證實(shí)乳鐵蛋白釋放的肽具有抗菌等作用,因此檢測(cè)人乳中的乳鐵蛋白及其肽段對(duì)于嬰兒健康的研究非常重要?，F(xiàn)有的人乳內(nèi)源肽的研究采用三氯乙酸沉淀法處理樣品,報(bào)道的結(jié)果中均未檢測(cè)到來(lái)源于乳鐵蛋白的內(nèi)源性肽段[22,23]。由圖5可見(jiàn),UF 2、UF 3和OMC法制備的樣品中均鑒定到乳鐵蛋白釋放的內(nèi)源肽,分別為21、38和19條,而其他3種方法制備的樣品未檢測(cè)到源于乳鐵蛋白的內(nèi)源肽。說(shuō)明不同樣品制備方法可能導(dǎo)致源于乳鐵蛋白的特異性肽段丟失。

圖 5 不同方法制備的樣品中釋放肽段數(shù)目最多的前10個(gè)母體蛋白質(zhì)

圖6展示了所鑒定到的內(nèi)源肽在母體蛋白質(zhì)上的覆蓋率,β-酪蛋白釋放的內(nèi)源肽數(shù)目最多,肽段在β-酪蛋白上的覆蓋率也最高,這與β-酪蛋白結(jié)構(gòu)疏松、親水性強(qiáng)的特點(diǎn)相關(guān)[24]。免疫球蛋白受體蛋白釋放的內(nèi)源肽數(shù)目較多,但蛋白質(zhì)覆蓋率相對(duì)較低,說(shuō)明免疫球蛋白受體蛋白釋放內(nèi)源肽的區(qū)域相對(duì)較集中。所有樣品中內(nèi)源肽在骨橋蛋白和αs1-酪蛋白的覆蓋率較高,UF 1、UF 2和PCPN 1法制備的樣品中內(nèi)源肽在骨橋蛋白和αs1-酪蛋白的覆蓋率均超過(guò)70%。UF 2、UF 3和OMC法制備的樣品中檢測(cè)到來(lái)源于乳鐵蛋白的內(nèi)源肽在乳鐵蛋白上的覆蓋率分別為14%、16%和19%,說(shuō)明源于乳鐵蛋白的內(nèi)源肽不是偶然檢測(cè)到的,而是以上3種制備方法有利于這類(lèi)肽的富集。OMC法制備的樣品中來(lái)源于κ-酪蛋白的肽段數(shù)目最多為84條,蛋白質(zhì)覆蓋率也最高為55%;該樣品也是唯一鑒定到6條來(lái)源于組蛋白H2B1-O型的內(nèi)源肽,蛋白質(zhì)覆蓋率為41%。以上結(jié)果說(shuō)明,不同的樣品制備方法直接影響特異性肽的富集,可根據(jù)研究目的選擇合適的制備方法。

圖 6 內(nèi)源肽在母體蛋白質(zhì)上的覆蓋率

3 結(jié)論

人乳成分復(fù)雜多變且樣品珍貴,樣品制備方法對(duì)人乳內(nèi)源肽研究有決定性的影響。本研究系統(tǒng)比較了不同樣品制備方法對(duì)于LC-MS/MS分析人乳內(nèi)源肽的影響,結(jié)果表明熱變性超濾法制備的樣品中內(nèi)源肽的數(shù)目多,可富集到源于乳鐵蛋白的內(nèi)源肽,是較理想的制備人乳內(nèi)源肽的方法。本文的研究結(jié)果表明人乳中存在對(duì)于嬰兒健康重要的源于乳鐵蛋白的內(nèi)源肽,文獻(xiàn)常用的樣品制備方法導(dǎo)致這類(lèi)內(nèi)源肽丟失而未被檢測(cè)到。因此,統(tǒng)一和規(guī)范樣品制備方法對(duì)于研究結(jié)果的可比性具有重要的意義,本研究可為人乳內(nèi)源肽的樣品制備方法的選擇提供借鑒。