李皇保，周俊，趙鳳慶，吳曉俊，閔捷

（嘉興市第一醫(yī)院/嘉興醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 嘉興 314000）

膽囊癌起病隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后較差[1]。雖然手術(shù)可以改善患者，但仍不理想[2]。在現(xiàn)有治療方案的基礎(chǔ)上探討膽囊癌發(fā)展的分子機制，尋找潛在的化學(xué)治療靶點具有重要意義。阿司匹林是非甾體抗炎藥，國內(nèi)外多項研究提示其可改善肝癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]及胰腺癌[6]的預(yù)后，可以降低膽囊癌的發(fā)病風(fēng)險[7]。但是阿司匹林在膽囊癌中的具體作用機制目前國內(nèi)外相關(guān)報道很少。本研究旨在通過阿司匹林干預(yù)膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD中Janus酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3，JAK/STAT3）信號通路中關(guān)鍵分子STAT3的表達(dá)水平及磷酸化水平，觀察阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞凋亡、增殖的影響，以及膽囊癌細(xì)胞凋亡、增殖與STAT3、磷酸化STAT3（pSTAT3）、髓細(xì)胞白血病因子-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的關(guān)系，探討阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞株凋亡、增殖影響的潛在分子機制，為膽囊癌的化學(xué)治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

GBC-SD細(xì)胞系（中科院細(xì)胞庫），1640 培養(yǎng)基（Gibco公司），10%胎牛血清（Biowest），DMSO、噻唑藍(lán)（MTT），阿司匹林（Sigma），0.25%胰酶-EDTA（Procell），VEGF抗體、MCL-1抗體（Sigma），STAT3抗體、磷酸化STAT3抗體（Abcam），Trizol液（Biosharp），逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（VAZYME），凋亡試劑盒（eBioScience），STAT3激動劑（Colivelin，MedChemExpress）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇后的細(xì)胞于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2）。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿80%～90%，0.25%胰酶消化細(xì)胞，用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞按適當(dāng)比例傳代，約2～3 d傳代1次。

1.3 細(xì)胞增殖檢測

MTT法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種在96孔不含胎牛血清的平板中，每孔80 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)1 500，并在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，然后各組分別加入空白溶劑、1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L阿司匹林溶液20 μL，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后每孔加MTT貯存液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄細(xì)胞上清液后每孔加入10 μL的DMSO，10 min后采用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處的各孔吸光度（A）值，5 mmol/L組未處理的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，棄細(xì)胞上清液后每孔加入10 μL的DMSO，10 min后采用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處的各孔吸光度（A）值，按公式計算：細(xì)胞存活率（%）=藥物組A值/對照組A值×100%。

1.4 GBC-SD細(xì)胞凋亡檢測

流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)同前，待對照組（空白對照，無阿司匹林）及實驗組（阿司匹林，5 mmol/L）6孔板細(xì)胞生長至覆蓋率約為70%時誘導(dǎo)凋亡，離心、洗滌，加入10 μL Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min，上機檢測，分析結(jié)果。

1.5 MCL-1、VEGF和STAT3的mRNA檢測

Real-time PCR。根據(jù)GBC-SD細(xì)胞生長速度將其按400 000細(xì)胞每孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞板中，每孔接種2 mL細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，孵育過夜。處理組加入阿司匹林，對照組加入等體積無水乙醇，阿司匹林濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L，乙醇濃度為1%。細(xì)胞板放回培養(yǎng)箱，避光孵育6 h。結(jié)束孵育后，去除貼壁細(xì)胞上清，收集細(xì)胞置于1 mL Trizol試劑置于-80 ℃中保存。按照Trizol法提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后PCR檢測MCL-1、VEGF和STAT3 的mRNA表達(dá)，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40個循環(huán)。采用相對定量法（2-△△Ct法）計算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 STAT3、pSTAT3、MCL-1和VEGF的蛋白檢測

Western blotting。細(xì)胞培養(yǎng)同前。為檢測阿司匹林濃度對以上蛋白的表達(dá)影響，分組設(shè)置為（A）空白對照組、阿司匹林濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L組；為檢測STAT3激動劑對以上蛋白表達(dá)的影響，分組設(shè)置為（B）空白對照組、阿司匹林組（5 mmol/L）、激動劑+空白組、激動劑+阿司匹林組（5 mmol/L）。藥物處理后細(xì)胞板放回培養(yǎng)箱，避光孵育48 h。結(jié)束孵育后，去除貼壁細(xì)胞上清，收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后提取各組細(xì)胞的總蛋白，灌膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜，共3次，最后顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

MTT、流式細(xì)胞檢測術(shù)及PCR結(jié)果使用Graph-Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖，各組別間的比較采用t檢驗（2組間比較）或單因素方差分析（3組以上比較）；Western blotting結(jié)果比對電泳條帶灰度，對每條條帶重復(fù)測量3次，根據(jù)目標(biāo)蛋白與GAPHD蛋白的相對灰度值計算P值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林對GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

48 h時空白對照、1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L 4個濃度點下各孔細(xì)胞存活率分別為（100.00±1.35）%、（95.17±3.97）%、（87.40±5.59）%、（81.42±2.55）%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對GBC-SD的增殖抑制呈濃度依賴，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1 mmol/Lvs空白對照：t=-1.59，P=0.32；3 mmol/Lvs空白對照：t=-4.15，P＜0.05；5 mmol/Lvs空白對照：t=-6.12，P＜0.05；組間方差分析：F=14.68，P＜0.001）。將未經(jīng)處理的阿司匹林5 mmol/L組繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，同前處理后檢測吸光度值為（37.17±0.49）%，與48 h組的阿司匹林處理組進(jìn)行比較，結(jié)果證明阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞株增殖抑制呈時間依賴，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=29.5，P＜0.001）。見圖1。

圖1 阿司匹林抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖

2.2 阿司匹林對GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響

對照組細(xì)胞凋亡比為（1.40±0.11）%，5mmol/L阿司匹林組的細(xì)胞凋亡比為（8.32±0.16）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-62.062，P＜0.001），提示阿司匹林促進(jìn)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.3 阿司匹林對膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中MCL-1、VEGF和STAT3 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可下調(diào)MCL-1[空白對照：1.40±0.52；1 mmol/L：1.04±0.27vs空白對照，t=-2.39，P=0.11）；3 mmol/L：0.96±0.13vs空白對照，t=-3.09，P＜0.05）；5 mmol/L：0.81±0.57vs空白對照，t=-4.20，P＜0.05）]、VEGF[空白對照：3.85±0.53；1 mmol/L：3.82±1.09vs空白對照，t=-0.04，P=0.99）；3 mmol/L：2.11±0.78vs空白對照，t=-2.90，P＜0.05）；5 mmol/L：1.19±0.82vs空白對照，t=-4.85，P＜0.05）]mRNA的相對表達(dá)，差異與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（MCL-1，F(xiàn)=6.30，P＜0.05；VEGF，F(xiàn)=11.11，P＜0.05）。與對照組相比，阿司匹林對STAT3（空白對照：1.51±0.17、1 mmol/L：1.48±0.28、3 mmol/L：1.48±0.29、5 mmol/L：1.56±0.26）mRNA的表達(dá)的影響無顯著差異（F=0.03，P＞0.05）。見圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測阿司匹林對GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響

2.4 阿司匹林對GBC-SD細(xì)胞中MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可下調(diào)MCL-1、VEGF、pSTAT3蛋白的表達(dá)，電泳條帶與對照組相比灰度均逐漸降低（MCL-1：空白對照：1.03，1 mmol/L：0.69，3 mmol/L：0.47，5 mmol/L：0.08，F(xiàn)=5935，P＜0.05；VEGF：空白對照：1.57，1 mmol/L：1.22，3 mmol/L：0.61，5 mmol/L：0.18，F(xiàn)=6143，P＜0.05；pSTAT3：空白對照：1.32，1 mmol/L：1.39，3 mmol/L：0.71，5 mmol/L：0.31，F(xiàn)=6688，P＜0.05）。阿司匹林對STAT3蛋白表達(dá)的電泳條帶與對照組相比灰度差異不明顯（STAT3：空白對照：1.43，1 mmol/L：1.50，3 mmol/L：1.40，5 mmol/L：1.46，F(xiàn)=3.13，P＞0.05）。見圖4A。

2.5 STAT3激動劑處理后GBC-SD細(xì)胞中MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3蛋白表達(dá)情況

實驗條件為阿司匹林5 mmol/L，設(shè)置空白對照組、阿司匹林處理組、空白+激動劑組、阿司匹林+激動劑組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，加入激動劑后MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3電泳條帶灰度均增加（圖4B，組1vs組3，MCL-1：1.32vs1.50，t=-6.12，P＜0.05；VEGF：1.09vs2.08，t=-18.3，P＜0.05；STAT3：0.69vs1.77，t=-37.7，P＜0.05；pSTAT3：1.51vs2.13，t=-9.41，P＜0.05）。加入阿司匹林后，除STAT3（組1vs組2，0.70vs1.48，t=-57.1，P＜0.05；組3vs組4，1.77vs2.27，t=3.3，P＜0.05）異常外，MCL-1、VEGF和pSTAT3電泳條帶灰度均降低（圖4B，組1vs組2，MCL-1：1.32vs0.14，t=351.2，P＜0.05；VEGF：1.09vs0.24，t=55.8，P＜0.05；pSTAT3：1.51vs2.13，t=-9.41，P＜0.05；組3vs組4，MCL-1：1.51vs0.37，t=34.3，P＜0.05；VEGF：2.07vs0.77，t=24.4，P＜0.05；pSTAT3：2.13vs0.78，t=-22.0，P＜0.05）。在激動劑作用后，除STAT3變化與阿司匹林加入情況不一致外（但與激動劑加入情況一致），雖然加入阿司匹林可使MCL-1、VEGF和pSTAT3電泳條帶相對灰度降低（圖4B，組3vs組4，同前），但與無激動劑組相比，條帶相對灰度較高（圖4B，組2vs組4，MCL-1：0.14vs0.37，t=-16.9，P＜0.05；VEGF：0.24vs0.77，t=-40.5，P＜0.05；pSTAT3：0.33vs0.78，t=-28.3，P＜0.05）。以上結(jié)果提示，阿司匹林不是通過影響STAT3 的表達(dá)，而是通過抑制STAT3 磷酸化從而下調(diào)MCL-1、VEGF的表達(dá)。

圖3 阿司匹林對GBC-SD細(xì)胞中MCL-1、VEGF和STAT3 mRNA表達(dá)的影響

圖4 不同濃度阿司匹林（A）及激動劑（B）對GBC-SD細(xì)胞中STAT3、pSTAT3、MCL-1和VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究表明慢性炎癥產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)會引起原癌基因活化和抑癌基因失活，進(jìn)而啟動腫瘤進(jìn)程，參與腫瘤的誘導(dǎo)、生長、血管生成及轉(zhuǎn)移[8]，同時慢性炎癥也會導(dǎo)致核因子kappa B（NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）等腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤細(xì)胞中被激活，從而級聯(lián)激活下游的效應(yīng)分子，在腫瘤微環(huán)境中形成復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[9-10]。Grusz等[9]認(rèn)為，阿司匹林作為非甾體類抗炎藥，可能通過抑制這些與炎癥和腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)的信號通路發(fā)揮抑癌作用。已有研究證實，在胰腺癌中阿司匹林可以同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖[11]。在前列腺癌中，也可以通過抑制JAK-STAT3信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤增殖[12]；另外在前列腺癌中，阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡和抑制增殖[13]。雖然流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)阿司匹林可降低膽囊癌發(fā)病風(fēng)險[7]，但是在機制研究方面目前國內(nèi)外相關(guān)報道很少。本研究初步表明，阿司匹林可以抑制JAK/STAT3 信號通路中關(guān)鍵分子STAT3 的磷酸化，進(jìn)而下調(diào)抗凋亡標(biāo)記分子MCL-1和細(xì)胞增殖標(biāo)記分子VEGF的表達(dá)水平，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖。

MCL-1基因是抗凋亡基因Bcl-2最主要的成員，具有Bcl-2家族基因的所有共同特征，在細(xì)胞抗凋亡中發(fā)揮廣泛作用，是抗凋亡家族的標(biāo)記分子和治療靶點[14]。膽囊癌中MCL-1的表達(dá)高于正常上皮組織，與腫瘤細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)[15]。結(jié)直腸癌[16]、乳腺癌[17]等腫瘤中也存在MCL-1基因及相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后、轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。既往研究表明，MCL-1是STAT3信號通路的下游效應(yīng)分子，被STAT3激活后發(fā)揮抗凋亡作用，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌化療耐藥[18]。本研究結(jié)果提示，在膽囊癌細(xì)胞中，STAT3激動劑可上調(diào)MCL-1蛋白表達(dá)水平，阿司匹林作為抑制劑可下調(diào)MCL-1 的蛋白表達(dá)水平，證實在膽囊癌中MCL-1為STAT3信號通路的下游分子。由于阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化下調(diào)MCL-1的表達(dá)，說明阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞的抑制作用一部分是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

VEGF由腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)產(chǎn)生，最主要的功能是促進(jìn)血管生成[19]，因VEGF通路激活是腫瘤增殖的基礎(chǔ)，VEGF通常作為標(biāo)記腫瘤增殖的常用參照基因[20-21]。已有研究證明VEGF在膽囊癌組織中有過度表達(dá)，并且與不良預(yù)后及轉(zhuǎn)移相關(guān)[22-23]。既往的研究多數(shù)認(rèn)為阿司匹林對于VEGF的影響主要是通過抑制COX-2過表達(dá)實現(xiàn)的[24]。然而其他研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可通過抑制JAK/STAT3通路[25]抑制結(jié)腸癌的生長，而該通路被相應(yīng)的抑制劑抑制后，可導(dǎo)致VEGF的下調(diào)[26]，但是阿司匹林是否直接通過抑制STAT3通路從而下調(diào)VEGF目前尚缺乏相關(guān)報道。本研究結(jié)果提示，STAT3 激動劑可上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平，證實VEGF為STAT3 信號通路的下游分子，同時阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化下調(diào)VEGF的表達(dá)，說明阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞的抑制作用一部分是通過下調(diào)VEGF表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖實現(xiàn)的。

綜上所述，MCL-1和VEGF都是炎癥相關(guān)JAK/STAT3 信號通路的下游分子，而阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化從而抑制STAT3信號通路的信號傳遞，進(jìn)而下調(diào)MCL-1 和VEGF表達(dá)，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

另外需要提及的是，雖然本研究探討了阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞的凋亡及增殖影響的可能機制，為膽囊癌的化學(xué)治療提供了新的治療依據(jù)，但仍有以下不足：（1）本研究僅使用了GBC-SD膽囊癌細(xì)胞系，未檢測阿司匹林在其他膽囊癌細(xì)胞系中的作用；（2）僅限于體外研究，未在動物模型中進(jìn)行體內(nèi)驗證；（3）由于已有較多研究提示阿司匹林通過阻斷細(xì)胞周期的G0/G1期向S期的進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27-28]，本研究未對阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞周期的阻斷時期做重復(fù)性研究；（4）在圖4B中，STAT3變化趨勢與是否加入阿司匹林相反，結(jié)合圖4A中的結(jié)果及文獻(xiàn)[27]，考慮可能為實驗誤差。雖然存在以上不足，但本研究在阿司匹林對膽囊癌細(xì)胞的作用機制上做出了有意義的嘗試，可以為后續(xù)研究提供參考。