孫楊，魏崇莉，趙彤，馬慧萍，景臨林*

1.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院 第一門診部，甘肅 蘭州 730050；2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院 藥劑科/全軍高原醫(yī)學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730050

心臟是專屬耗氧器官，容易遭受高原缺氧的損傷[1]。研究表明，低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心臟損傷的重要因素之一，而抗氧化劑能夠通過抑制氧化應(yīng)激改善心肌損傷[2]。天然抗氧化劑更是具有活性高、毒性低的優(yōu)勢，近年來備受關(guān)注[3]。甘松NardostachyschinensisBatal.以其干燥根及根莖入藥，具有理氣止痛、開郁醒脾的功效[4]。研究表明，甘松富含倍半萜烯、香豆素、黃酮、多酚和糖苷等化合物，具有抗癲癇、抗焦慮、抗驚厥、抗抑郁、抗瘧、抗氧化、抗炎、抗心肌缺血再灌注損傷、抑菌和改善血糖代謝等廣泛的生物活性[5-7]。課題組前期研究表明，甘松乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract fraction ofN.chinensis，EFNC)具有較好的體外抗氧化活性[8]。本研究考察EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)的心肌組織氧化應(yīng)激損傷的保護作用，為其合理應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

EFNC按照課題組報道的方法制備[8](總黃酮質(zhì)量分數(shù)>150 mg·g-1)；蘆丁(純度>98%)購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定和蛋白定量BCA法試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)等抗體購自Abcam公司；β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光法(ECL) Plus超敏發(fā)光液和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

FLYDWC50-IIC型低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)；CriterionTM型電泳槽(Bio-Rad公司)；Spectramax i3型多功能酶標儀(Molecular Devices公司)；Microfuge 22R型冷凍離心機(Beckman Coulter公司)；Tissuelyser-24型多樣品組織研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 動物

雄性清潔級BABL/c小鼠，4周齡，體質(zhì)量(20±2) g，由聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)2014-0029。

2 方法

2.1 常壓密閉缺氧實驗

將50只清潔級雄性BABL/C小鼠隨機分為缺氧模型組、蘆丁組(500 mg·kg-1)和EFNC高(500 mg·kg-1)、中(250 mg·kg-1)、低(125 mg·kg-1)劑量組，每組10只。按照相應(yīng)劑量連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次，缺氧模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，末次給藥后，將小鼠置于250 mL廣口瓶中(瓶內(nèi)放置5 g鈉石灰用于吸收二氧化碳)，密閉瓶蓋后開始計時，以最后一次大喘氣為小鼠死亡指標，紀錄小鼠的存活時間[9]。

2.2 低壓低氧誘導(dǎo)心肌組織損傷模型

將36只清潔級雄性BABL/c小鼠隨機分為對照組、低壓低氧模型組、蘆丁(500 mg·kg-1)組、EFNC(500 mg·kg-1)組，每組9只，連續(xù)灌胃給藥5 d，對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。末次給藥后，除對照組外，其余小鼠置于低壓低氧動物實驗艙中，以10 m·s-1升至海拔8000 m，12 h后再以10 m·s-1將實驗艙中氣壓升至環(huán)境大氣壓。小鼠眼眶取血，隨即脫臼處死，摘除心臟，并按照測定要求對其進行處理[10]。

2.3 血清中心肌損傷指標測定

每組分別取6只小鼠的血液標本，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清。LDH、CK和CK-MB活性按照相關(guān)試劑盒說明進行測定。

2.4 心肌組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標測定

每組分別取6只小鼠的心肌組織，稱定質(zhì)量后按1∶9加入冰0.9%氯化鈉溶液，使用組織研磨儀制備心肌組織勻漿，3500 r·min-1低溫(4 ℃)離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清。MDA、H2O2和GSH水平及SOD、CAT和GSH-Px活性按照相關(guān)試劑盒說明書進行測定。

2.5 心肌組織蛋白表達水平測定

每組分別取3只小鼠的心肌組織標本，稱定質(zhì)量后按1∶9加入RIPA裂解液，使用組織研磨儀制備心肌組織勻漿，12 000 r·min-1低溫(4 ℃)離心15 min(離心半徑為10 cm)，取上清，BCA法計算蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣，采用SDS-PAGE進行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)和β-actin(1∶1000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室溫孵育2 h，ELC發(fā)光，暗室曝光，灰度值用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 EFNC對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

如圖1所示，與模型組比較，EFNC中、高劑量組小鼠生存時間明顯延長(P<0.05，P<0.01)，具有一定的劑量依賴性。與蘆丁組比較，EFNC高劑量組小鼠存活時間略長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，在后續(xù)實驗中采用EFNC高劑量進行低壓低氧實驗。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 EFNC對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

3.2 EFNC對低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力顯著升高(P<0.01)，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著降低LDH、CK和CK-MB的活力(P<0.01)。

表1 EFNC對低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活性的影響

3.3 EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠心肌組織中H2O2和MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著降低H2O2和MDA水平(P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；圖3同。圖2 EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量的影響

3.4 EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中抗氧化體系的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠心肌組織中GSH水平和SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著提高GSH水平(P<0.01)和SOD、CAT、GSH-P活力(P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 EFNC對高原缺氧小鼠心肌組織中GSH、SOD、CAT和GSH-Px的水平的影響

3.5 EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以進一步升高缺氧小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 EFNC對低壓低氧小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

4 討論

高原是以低壓低氧為特征的極端環(huán)境，暴露其中會對包括心臟在內(nèi)的多個臟器造成損傷。本試驗結(jié)果表明，與對照組比較，低壓低氧模型組小鼠血清中LDH、CK和CK-MB等心臟功能指標均升高。血清中LDH、CK和CK-MB水平是反映心肌細胞膜喪失完整性的定量指標，其水平的升高提示低壓低氧影響了心肌細胞膜的完整性，造成了心肌損傷[11]。有報道指出，甘松揮發(fā)油能夠降低心肌缺血再灌注大鼠血清中CK-MB和心肌肌鈣蛋白(cTnT)水平，具有較好的心肌保護作用[12]。與前期的結(jié)果類似，EFNC預(yù)處理能顯著降低低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB水平，提示EFNC能夠維持心肌細胞膜的完整性，從而減輕心肌細胞損傷。

高原缺氧誘發(fā)心肌損傷的機制尚不完全明確。一個被普遍認可的觀點認為，氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮著重要作用[13]。低壓低氧能夠誘導(dǎo)細胞和組織中活性氧(ROS)的蓄積[14]，過量的ROS能夠與生物膜中的脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而改變生物膜的功能；也能夠攻擊DNA和蛋白質(zhì)，造成DNA損傷和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，進而對細胞造成損傷[15]。很多研究證明，通過減輕機體氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化能力，能夠減輕高原缺氧損傷[16]。本實驗結(jié)果顯示，低壓低氧模型組小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量較對照組顯著升高。H2O2是ROS的重要成員，其含量代表了ROS的水平。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量與脂質(zhì)過氧化水平呈正相關(guān)，能夠間接反映組織的損傷程度。而給予EFNC預(yù)處理能夠顯著降低心肌組織中H2O2和MDA水平，說明EFNC能夠通過抑制低壓低氧誘導(dǎo)的自由基蓄積和脂質(zhì)過氧化，緩解心肌組織損傷。

Nrf2是調(diào)控細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時也是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者[19]。正常生理情況下，Nrf2與Keap1蛋白結(jié)合存在于細胞質(zhì)中，通過靶向蛋白酶降解而保持Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性。ROS或親電子基團能夠促進Nrf2與Keap1中解離，游離的Nrf2從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞核，從而調(diào)控包括HO-1在內(nèi)的一系列抗氧化酶基因的表達[20]。HO-1是一種限速酶，可催化血紅素降解為一氧化碳、膽綠素和Fe2+等內(nèi)源性保護物質(zhì)從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[21]。最新研究表明，甘松能夠通過激活Nrf2/HO-1途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[22]。本實驗結(jié)果表明，低壓低氧條件下，心肌組織中ROS的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致Nrf2和HO-1水平上調(diào)，通過激活Nrf2/HO-1信號通路應(yīng)激性的抵抗低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。經(jīng)EFNC預(yù)處理能夠進一步上調(diào)Nrf2和HO-1的表達，提示EFNC對低壓低氧誘導(dǎo)心肌組織損傷的保護作用可能部分是通過激活Nrf2/HO-1信號途徑介導(dǎo)的。

綜上所述，EFNC對高原缺氧小鼠心肌組織的保護作用機制與其清除過量自由基、激活Nrf2/HO-1信號途徑、緩解機體氧化應(yīng)激有關(guān)。