凌霄，李偉霞，王曉艷，趙婭，曹英杰

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部/中藥臨床評價技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001

芍藥湯是“金元四大家”之一劉完素所創(chuàng)的名方，首載于《素問病機(jī)氣宜保命集》，后世醫(yī)家皆推此方為治療濕熱痢疾之主方，目前臨床上仍被廣泛應(yīng)用于濕熱下利腹瀉。芍藥湯全方由白芍Paeoniae Radix Alba、黃連Coptidis Rhizoma、當(dāng)歸Angelicae Sinensis Radix、木香Aucklandiae Radix、檳榔Arecae Semen、甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma、大黃Rhei Radix et Rhizoma、黃芩Scutellariae Ariae Radix、肉桂Cinnamomi Cortex組成，是中醫(yī)反治法的代表方劑。目前，國內(nèi)外對芍藥湯的研究以臨床研究和藥理實(shí)驗(yàn)研究為主，該方化學(xué)成分的研究集中在芍藥苷、小檗堿等成分的含量測定。有學(xué)者對芍藥湯開展了指紋圖譜研究，確定了其中13個共有峰，但僅對其中的3個峰進(jìn)行了成分識別[1]。陳琳等[2]用高效液相色譜法測定了芍藥湯中鹽酸小檗堿的含量。但目前，芍藥湯整體化學(xué)輪廓仍不清晰，方中成分的定性、定量分析較為欠缺，嚴(yán)重制約了芍藥湯的深入研究和現(xiàn)代化研發(fā)。

隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)在中藥成分分析中的應(yīng)用越來越多。UPLC-Q-TOF-MS可給出化合物的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量及二級碎片信息，可以較準(zhǔn)確地推測未知化合物的結(jié)構(gòu)。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS對芍藥湯水煎液中的化學(xué)成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測鑒定，共鑒定了33個成分，為芍藥湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制及現(xiàn)代化開發(fā)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材

實(shí)驗(yàn)所用藥材均購自張仲景大藥房，由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥檢室施鈞瀚副主任藥師鑒定分別為毛茛科植物芍藥PaeoniatactiloraPall.的干燥根、毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根、菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根、棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖、蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖、唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根和樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹皮。

1.2 試劑

對照品芍藥苷(純度：96.8%，批號：110736-201842)、大黃素甲醚(純度：99.0%，批號：110758-201616)、黃芩苷(純度：95.4%，批號：110715-201821)、漢黃芩苷(純度：98.5%，批號：112002-201702)、漢黃芩素(純度：99.0%，批號：111514-201706)、甘草酸二銨(純度：93.2%，批號：101050-201101)、甘草苷(純度：95.0%，批號：111610-201607)、鹽酸小檗堿(純度：85.9%，批號：110713-201814)、鹽酸藥根堿(純度：89.5%，批號：110733-201609)均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品白芍苷(純度：99.0%，批號：16051601)購于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購于德國Merck公司；甲酸(色譜純，Tedia公司)；實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈蒸餾水。

1.3 儀器

UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)：ACQUITY-UPLC型高效液相色譜儀、XEVO-G2XSQTOF飛行時間質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI，美國Waters公司)。

2 方法

2.1 對照品溶液制備

分別稱取芍藥苷、大黃素甲醚、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、甘草酸二銨、甘草苷、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、白芍苷約1 mg，精密稱定，用甲醇溶解，配制至質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品母液。取上述對照品母液適量，用甲醇稀釋為0.02 mg·mL-1的溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

按《素問病機(jī)氣宜保命集》中芍藥湯的各味藥配比[3]，采用臨床使用中的煎煮方法，稱取白芍30 g、黃連15 g、當(dāng)歸15 g、木香6 g、檳榔6 g、甘草6 g、大黃9 g、黃芩15 g、肉桂5 g至圓底燒瓶中，加水浸泡30 min后，第1次加6倍量水(約650 mL)，煎煮40 min后，2層紗布濾過，殘渣加4倍量水(約400 mL)，煎煮30 min后，兩層紗布濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至1 g·mL-1(以生藥量計)。取其中2 mL濃縮液，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，15 000×g離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，作為供試樣品，待測。

2.3 液相色譜分析條件

采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～20%B；10～20 min，20%B；20～35 min，20%～25%B；35～40 min，25%～60%B；40～50 min，60%～80%B；50～51 min，80%～100%B；51～55 min，100%B；55～60 min，100%～10%B)；體積流量0.4 mL·min-1，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

2.4 Q-TOF-MS分析條件

電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子掃描模式；毛細(xì)管電壓2500 V；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣體積流量600 L·h-1；源溫度100 ℃；錐孔氣體積流量50 L·h-1；亮氨酸-腦啡肽溶液在線校正(正離子模式mz556.277 1，負(fù)離子模式mz554.261 5)；掃描范圍mz：100～1000，掃描方式為全掃描。采用Waters UNIFI軟件對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分分析

共鑒定33個化學(xué)成分，其中化合物1、2、5～7、10、11為萜類化合物，化合物15、29、32為蒽醌類化合物，化合物3、9、13、23、25～28、30、31為黃酮類化合物，化合物4、17～22、24為生物堿類化合物，芍藥湯水煎液樣品在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。主要成分對照品及樣品質(zhì)譜圖見圖2～3。

注：A.正離子模式；B.負(fù)離子模式。圖1 芍藥湯水煎液的正、負(fù)離子模式下的總離子流圖

注：A.白芍苷；B.大黃素甲醚；C.甘草苷；D.甘草酸；E.漢黃芩苷；F.漢黃芩素；G.黃連堿；H.黃芩苷；I.芍藥苷；J.小檗堿；K.藥根堿；圖3同。圖2 芍藥湯水煎液中主要成分對照品質(zhì)譜圖

圖3 芍藥湯水煎液樣品中主要成分質(zhì)譜圖

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1萜類化合物 芍藥中的化合物多為萜類化合物，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了7個萜類化合物，下面主要解析代表性成分芍藥苷和白芍苷的結(jié)構(gòu)鑒定過程?；衔?在負(fù)離子模式下得到甲酸加和離子峰mz525.160 3[M+HCOO]-，mz449[M+HCOO-C3H8O2]-，脫去1分子苯甲酸乙酯和水形成特征碎片離子mz327[M+HCOO-C3H8O2-H2O-HCOO]-，脫去糖基形成特征碎片離子mz165[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4]-，再脫去羧基后形成特征碎片離子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4-CO2]-，結(jié)合文獻(xiàn)報道[3-7]和與對照品對比(圖2～3)，確定化合物7為芍藥苷。

化合物5在負(fù)離子模式下得到甲酸加和離子峰mz525.110 2[M+HCOO]-、準(zhǔn)分子離子峰mz479[M-H]-，推測其分子式為C24H30O13，脫去1分子苯甲酸，形成特征碎片離子mz357[M+HCOO-C7H7O2-HCOO]-，脫去1個糖苷形成特征碎片離子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H12O4-HCOO]-，查閱文獻(xiàn)[4-8]，與白芍苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律一致，與對照品對比后(圖2～3)，確定化合物5為白芍苷。芍藥湯中代表性萜類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖4。

3.2.2蒽醌類成分 大黃中含有大量蒽醌類成分。本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了3個蒽醌類成分，下面主要解析代表性成分大黃素甲醚的結(jié)構(gòu)鑒定過程。在負(fù)離子模式下，化合物29的準(zhǔn)分子離子峰為mz283.110 2[M-H]-，推斷其分子式為C16H12O5，在質(zhì)譜裂解過程中，脫去甲基，產(chǎn)生特征碎片離子mz268[M-H-CH3]-，查閱文獻(xiàn)[9-11]，與大黃素甲醚的主要裂解規(guī)律一致，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物29為大黃素甲醚。大黃素甲醚質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖5。

圖4 芍藥湯中代表性萜類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律

圖5 芍藥湯中代表性蒽醌類成分大黃素甲醚質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.2.3黃酮類化合物 黃芩和甘草中的化合物多為黃酮類化合物，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定出10個黃酮類成分，下面主要解析4個代表性成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程。在負(fù)離子模式下，化合物25的準(zhǔn)分子離子峰為mz445.077 0[M-H]-，推斷其分子式為C21H18O11，誤差為-0.4×10-6。在質(zhì)譜裂解過程中，其準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖羧基產(chǎn)生特征碎片離子mz269[M-gluA-H]-，特征碎片mz269，繼續(xù)脫去CO，產(chǎn)生特征碎片離子mz239[M-gluA-CO-H]-。查閱文獻(xiàn)[11-13]和對照品比對后(圖2～3)，發(fā)現(xiàn)與黃芩苷的主要裂解特征一致，確定化合物25為黃芩苷。

在負(fù)離子模式下，化合物28的準(zhǔn)分子離子峰為mz459.112 3[M-H]-，推斷其分子式為C22H20O11。在裂解過程中，其準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖羧基產(chǎn)生特征碎片離子mz283[M-gluA-H]-，準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖羧基和甲基產(chǎn)生碎片離子mz268[M-gluA-CH3-H]-，與文獻(xiàn)報道的裂解特征一致[11-12]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物28為漢黃芩苷。

在正離子模式下，化合物30的準(zhǔn)分子離子峰為mz285.100 1[M+H]+，推斷其分子式為C16H12O5，其準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基，產(chǎn)生特征碎片離子mz270[M-CH3-H]+，該裂解特征和文獻(xiàn)報道一致[12-13]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物30為漢黃芩素。

在正離子模式下，化合物8的準(zhǔn)分子離子峰為mz419.251 4[M+H]+，其準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖基和樹膠醛糖基得到特征離子碎片mz271[M+H-glucosyl-arabinosyl]+，負(fù)離子質(zhì)譜中捕捉到準(zhǔn)分子離子峰417.119 0[M-H]-，推測分子式為C21H22O9，結(jié)合文獻(xiàn)報道[14-15]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物8為甘草苷。

在負(fù)離子模式下，化合物31的準(zhǔn)分子離子峰為mz821.203 6[M-H]-，其準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖醛酸基，得到特征離子碎片mz645[M-gluA-H]-，脫去2個葡萄糖醛酸基，得到特征離子碎片mz469[M-gluA×2-H]-，查閱文獻(xiàn)[15-16]，與甘草酸主要裂解特征一致，與甘草酸對照品比對后(圖2～3)，確定化合物31為甘草酸。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，含葡萄糖醛酸-O-苷類化合物通常會產(chǎn)生失去葡萄糖醛酸基(mz176)的特征碎片離子。芍藥湯中代表性黃酮類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖6。

3.2.4生物堿類化合物 黃連中的主要成分為生物堿類成分，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了8個生物堿類成分，下面主要解析3個代表性成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程?；衔?2的準(zhǔn)分子離子峰為mz336.012 1，黃連中的生物堿為季胺型生物堿，其準(zhǔn)分子離子峰即為相對分子質(zhì)量，因此推測化合物22的分子式為C20H17NO4，準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基后進(jìn)一步脫去與N相連的H，形成特征碎片離子mz320[M-CH4]+，準(zhǔn)分子離子峰脫去1個甲基和CO后形成特征碎片離子mz291[M-CH3-CO]+，查閱文獻(xiàn)[16-18]，與小檗堿的主要裂解特征一致，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物22為小檗堿，質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖7。

化合物21的準(zhǔn)分子離子峰為mz338.021 6，推測其分子式為C20H19NO4，其準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基后脫去與N相連的H，形成特征碎片離子mz322[M-CH4]+，碎片離子mz322[M-CH4]+脫去CO，形成特征碎片離子mz294[M-CH4-CO]+。上述裂解與文獻(xiàn)報道藥根堿的主要裂解特征一致[16-18]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物21為藥根堿。

化合物17的準(zhǔn)分子離子峰為mz320.142 2[M]+，推測其分子式為C19H13NO4，脫去CH2O后形成特征碎片離子mz290[M-CH2O]+，與文獻(xiàn)中黃連堿裂解規(guī)律一致[16-18]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物17為黃連堿。芍藥湯水煎液主要化學(xué)成分鑒定結(jié)果見表1。

圖6 芍藥湯中代表性黃酮類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律

圖7 芍藥湯中小檗堿質(zhì)譜裂解規(guī)律

表1 芍藥湯水煎液主要化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

4 討論

芍藥湯全方由9味中藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對芍藥湯水煎液主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。鑒別出的主要化合物來源于芍藥、黃連、黃芩、大黃、當(dāng)歸和甘草，方中肉桂、木香中的揮發(fā)性成分較少鑒別，其原因可能是提取方式的選擇和藥物用量大小。由于臨床中芍藥湯的使用方式以水煎服為主，為了更加準(zhǔn)確地了解芍藥湯臨床實(shí)際應(yīng)用時的有效成分，本研究中湯液的制備方式與臨床實(shí)際應(yīng)用保持一致，采用水煎煮，而木香、肉桂中的標(biāo)志性成分揮發(fā)性較強(qiáng)，在煎煮中容易損失，且木香、肉桂在全方中用量較小，因此未鑒別出木香、肉桂中的大量揮發(fā)性成分，后續(xù)需要針對芍藥湯中的揮發(fā)性成分專門設(shè)計考察提取工藝，對方中揮發(fā)性成分進(jìn)行更加完善的分析。

本研究的色譜分離結(jié)果顯示，部分色譜峰沒有完全分離，但是利用質(zhì)譜高分辨的特點(diǎn)，可以通過相對分子質(zhì)量的差異，準(zhǔn)確區(qū)分不同化合物，通過準(zhǔn)分子離子峰和二級質(zhì)譜產(chǎn)生的特征性碎片離子，可對芍藥湯水煎液進(jìn)行定性分析。但本研究仍存在許多不足，部分藥物的部分成分未成功鑒別，而從總離子流圖中可看出，仍有部分響應(yīng)值較高的峰，其質(zhì)量數(shù)、碎片離子數(shù)據(jù)未能與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道匹配，提示芍藥湯水煎液中仍有許多未知成分，需要進(jìn)一步研究探索。

本研究首次采用UPLC-TOF-MS鑒定芍藥湯水煎液中33個化學(xué)成分，該法可以簡便、快速地對方劑中化學(xué)成分進(jìn)行定性研究，有利于深入研究芍藥湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，芍藥湯中的揮發(fā)性成分在傳統(tǒng)的水煎法中損失較大，對芍藥湯中揮發(fā)性成分需要專門設(shè)計提取工藝，以便進(jìn)一步的鑒別分析。