凌書建，楊麗萍，陶劍光，王小飛，蘇曉利，王杰

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

燒傷是較為常見的外傷性疾病，根據(jù)損傷程度可分為Ⅰ度、Ⅱ度、深Ⅱ度和Ⅲ度，其中以深Ⅱ度燒傷最為常見，并且預后變數(shù)較大，治療不及時或處理不當將導致燒傷創(chuàng)面加深而增加治療難度。病理生理學研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激和炎癥反應在創(chuàng)面病變進展中具有重要作用，成為燒傷治療藥物研究的靶點[1-2]。大蒜素是天然存在的一種二烯丙基三硫化物，具有較強的抗氧化、抗炎等生物學活性[3-5]，但大蒜素對燒傷創(chuàng)面氧化應激和炎癥反應是否具有抑制作用尚未見文獻報道。本實驗制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型并給予大蒜素進行治療，以研究大蒜素對燒傷創(chuàng)面氧化應激和炎癥反應的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠150只，7周齡，體質(zhì)量210～240 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(冀)2018-004；飼養(yǎng)環(huán)境為光照-黑暗12 h/12 h，溫度(25±1) ℃。

1.2 試藥

大蒜素注射液(規(guī)格為2 mL：30 mg，批號：20190224，徐州萊恩藥業(yè)有限公司)；乳酸鈉林格注射液(批號：20190513，石家莊四藥有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒和末端標記法(TUNEL)試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)；增強化學發(fā)光法(ECL)超敏化學發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

YLS-5Q型燙傷儀(天津科技發(fā)展有限公司)；CUT 4050型石蠟切片機(德國Leica公司)；CKX41型倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；DY89-2型勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Allegra 21R型低溫離心機(美國Beckman公司)；Multiskan MK-3型酶標儀(芬蘭Thermo公司)；Tetra Systerm型垂直電泳槽、Power Pac Basic型轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后開展實驗，應用隨機數(shù)字表法隨機分為5組，即假手術(shù)組，模型組，大蒜素低、中、高劑量(5、10、20 mg·kg-1)組，每組30只。實驗過程嚴格按照倫理委員會批準的實驗方案進行。

2.2 模型制備與給藥

制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型[6]。實驗前動物禁食禁水12 h，麻醉后剃除背部毛發(fā)并用硫化鈉溶液(8%)脫毛、75%乙醇消毒。假手術(shù)組大鼠立即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液以抗休克處理；其余各組通過燙傷儀燙傷5 s制備模型，儀器參數(shù)設置為壓力0.03 MPa、溫度106 ℃，行病理學檢查判斷造模成功(圖1，大部分真皮層細胞壞死，部分毛囊等附件殘存)，立即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液。造模完成后，大蒜素低、中、高劑量組大鼠分別立刻以5、10、20 mg·kg-1劑量腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組腹腔注射給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為2 mL·kg-1，每日1次，共給藥14 d。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組。圖1 大鼠創(chuàng)面皮膚病理切片(HE，×200)

2.3 創(chuàng)面組織病理學檢查和細胞凋亡觀察

各組隨機取10只大鼠，頸椎脫臼致死，取創(chuàng)面皮膚組織，置于4%多聚甲醛溶液72 h固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)、展片后：1)行HE染色，梯度乙醇脫蠟、二甲苯透明后封片，通過倒置光學顯微鏡觀察組織病理學改變。2)按照TUNEL試劑盒操作方法進行處理，封片通過倒置光學顯微鏡觀察(細胞核黃褐色為陽性著色)；每張切片隨機選取5個互不重疊的視野，分別計數(shù)視野內(nèi)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，計算平均值，并按照公式(1)計算凋亡指數(shù)(AI)。

AI=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

(1)

2.4 創(chuàng)面愈合率和含水量計算

各組隨機取10只大鼠，于給藥前和給藥第14天后對皮膚燒傷創(chuàng)面進行拍照，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量創(chuàng)面面積，按照公式(2)計算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率=(1-未愈合創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%

(2)

采用干濕比重法測定創(chuàng)面組織含水量。頸椎脫臼處死大鼠，取創(chuàng)面組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗、濾紙拭干后稱定質(zhì)量，計為濕質(zhì)量(W1)；置烤箱中90 ℃恒溫烘烤至恒定質(zhì)量，計為干質(zhì)量(W2)，按照公式3計算含水量。

含水量=(W1-W2)/W1×100%

(3)

2.5 生化指標檢測

取各組剩余的10只大鼠，經(jīng)腹主動脈取血并離心(1500 r·min-1、5 min，離心半徑為10 cm)。取血清，按照ELISA試劑盒說明處理后，通過酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平。

大鼠取血后，經(jīng)頸椎脫臼致死后，取創(chuàng)面組織，剪碎、加入9倍量4 ℃冷裂解液研磨勻漿，低溫4 ℃離心(3500 r·min-1、10 min，離心半徑為10 cm)。取上清液，按照各試劑盒依步驟處理后，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、高錳酸鉀滴定法測定CAT活性、比色法測定MPO活性、硫代巴比妥酸法測定MDA水平。

2.6 Western blotting法檢測創(chuàng)面組織p-PI3K、NF-κB蛋白表達水平

取2.5項下制備的組織勻漿液，低溫4 ℃離心(12 000 r·min-1、15 min，離心半徑為10 cm)取上清，BCA法測定總蛋白含量后，依次行凝膠電泳、轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，滴加p-PI3K、NF-κB、β-actin單抗后，4 ℃孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃振蕩孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后滴加ECL顯色發(fā)光，運用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶。以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量目標蛋白表達量。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面組織病理學改變的影響

經(jīng)HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠創(chuàng)面組織可見真皮下層組織水腫，膠原纖維腫脹、斷裂，炎性細胞浸潤等病理學形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織可見白色皮粒形成、上皮組織排列整齊，汗腺和皮脂腺結(jié)構(gòu)完整、排列整齊但仍較表淺，炎性細胞浸潤明顯好轉(zhuǎn)；其中大蒜素高劑量組效果較優(yōu)，見圖2。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.大蒜素5 mg·kg-1；D.大蒜素10 mg·kg-1；E.大蒜素20 mg·kg-1；圖3～4同。圖2 各組大鼠燒傷創(chuàng)面組織病理學改變(HE，×200)

3.2 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面細胞凋亡的影響

經(jīng)TUNEL染色后觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠創(chuàng)面組織存在極少量凋亡細胞。模型組大鼠創(chuàng)面凋亡細胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多。而經(jīng)大蒜素低、中、高劑量治療14 d能夠不同程度降低燒傷創(chuàng)面凋亡細胞數(shù)量，以大蒜素高劑量組最為顯著，見圖3。

AI計算結(jié)果表明，模型組大鼠創(chuàng)面組織細胞AI[(49.03±6.17)%]顯著高于假手術(shù)組[(4.08±0.75)%，P<0.01]。與模型組比較，經(jīng)大蒜素低、中、高劑量[AI分別為(42.04±5.27)%、(30.15±4.82)%、(22.59±4.51)%]治療14 d能夠顯著降低燒傷創(chuàng)面細胞AI(P<0.05，P<0.01)。

3.3 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合率和含水量的影響

與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠創(chuàng)面含水量顯著升高(P<0.01)，而經(jīng)大蒜素中、高劑量治療14 d能夠降低大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面含水量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見表1。

圖3 各組大鼠燒傷創(chuàng)面細胞凋亡情況(TUNEL，×200)

表1 各組大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率和含水量

3.4 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面組織SOD、CAT、MPO活性和MDA水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織SOD、CAT、MPO活性顯著降低，且MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)大蒜素中、高劑量治療14 d能夠提高大鼠創(chuàng)面組織SOD、CAT、MPO活性，并降低MDA水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

3.5 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷后血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)大蒜素中、高劑量治療14 d能夠降低大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表3。

3.6 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面p-PI3K、NF-κB蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織p-PI3K、NF-κB蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，經(jīng)大蒜素中、高劑量治療14 d能夠下調(diào)p-PI3K、NF-κB表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見圖4和表4。

4 討論

燒傷破壞局部血管導致創(chuàng)面組織病理性缺血缺氧，誘發(fā)氧化應激和炎癥反應，阻礙修復細胞的增殖、遷移而影響創(chuàng)面愈合[7-8]。因此，燒傷初期給予抗氧化、抗炎治療措施，對燒傷創(chuàng)面恢復有積極意義。大蒜素是天然存在于百合科蔥屬植物大蒜鱗莖中的一種二烯丙基三硫化物，具有較強的抗氧化、抗炎活性。本實驗采用壓力0.03 MPa、溫度106 ℃持續(xù)作用5 s的方法制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型并腹腔注射大蒜素進行研究，發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠改善燒傷創(chuàng)面組織病變、提高創(chuàng)面愈合率、抑制創(chuàng)面細胞凋亡，提示其對深Ⅱ度燒傷大鼠燒傷創(chuàng)面愈合具有促進作用。

表2 大蒜素對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面組織SOD、CAT、MPO活性和MDA水平的影響

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平

圖4 各組大鼠燒傷創(chuàng)面p-PI3K、NF-κB蛋白表達

表4 各組大鼠燒傷創(chuàng)面p-PI3K、NF-κB蛋白表達

燒傷創(chuàng)面氧供不足導致活性氧(ROS)大量生成，抗氧化酶(SOD和CAT)過度消耗導致ROS代謝不及時而蓄積，為氧化應激反應提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。SOD是體內(nèi)唯一以ROS為底物的還原酶，對ROS具有高效的催化還原作用，其產(chǎn)物過氧化氫(H2O2)能夠在CAT作用下進一步被催化還原而生成水和氧，因此SOD/CAT還原酶路徑對維持ROS平衡至關(guān)重要[10]。MPO是存在于中性粒細胞中的一種過氧化氫酶，對機體清除ROS具有重要作用[11]。MDA是ROS氧化脂質(zhì)產(chǎn)生的終產(chǎn)物。所以SOD、CAT、MPO活性及MDA水平能夠反映氧化應激水平。本研究結(jié)果顯示，大蒜素能夠有效改善大鼠燒傷創(chuàng)面SOD、CAT、MPO活性并降低MDA水平，提示其對深Ⅱ度燒傷大鼠燒傷創(chuàng)面氧化應激具有抑制作用。

燒傷能夠刺激促炎介質(zhì)大量釋放，包括IL、TNF等，其中IL-1β和TNF-α是觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應的主要介質(zhì)[12]；并且IL-1β和TNF-α作為趨化因子能夠進一步促進IL-1β和TNF-α釋放；此外IL-1β水平升高能夠刺激另2種炎癥細胞因子IL-6、IL-8表達水平上調(diào)[13-14]，從而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療能夠有效降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，提示大蒜素對深Ⅱ度燒傷大鼠炎癥反應具有抑制作用。

PI3K由脂類和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成，p-PI3K能夠通過其靶基因表達和活化而間接參與調(diào)節(jié)細胞生長、細胞凋亡、炎癥反應等多種生物活動[15]。NF-κB進核后能夠作為轉(zhuǎn)錄因子而促進 TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放而激發(fā)炎癥反應，但p-PI3K參與NF-κB核轉(zhuǎn)位的調(diào)控[16]，所以p-PI3K/NF-κB信號通過對炎癥反應調(diào)控具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療能夠有效下調(diào)p-PI3K、NF-κB蛋白表達，提示大蒜素抑制p-PI3K/NF-κB信號通路可能是其抑制深Ⅱ度燒傷大鼠炎癥反應的分子機制之一。

綜上所述，大蒜素能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應而促進大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合，其機制可能與改善抗氧化酶活性、抑制p-PI3K/NF-κB信號通路有關(guān)。