吳 濤，苗 牛，張明勤，劉陽(yáng)陽(yáng)，楊冬誼

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第2 位，嚴(yán)重影響人們健康［1-2］。 隨著介入技術(shù)的發(fā)展，TACE 已被認(rèn)為是治療HCC 的一線(xiàn)治療方案，能夠提高患者的2 年生存率［3-4］。 然而，經(jīng)臨床隨訪(fǎng)得知相同腫瘤分期的HCC 患者接受TACE 治療后存在療效差異較大的情況［5］，因此，篩選出接受TACE 治療獲益大的HCC 患者具有重要意義，不僅可節(jié)省醫(yī)療資源，還可達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。 然而，目前臨床缺乏有效的指標(biāo)評(píng)價(jià)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后。

miRNA 是一種由20～24 個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)功能，但可參與細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡等過(guò)程［6］。 miR-527 屬于miRNA，已被報(bào)道參與腦膠質(zhì)瘤［7］、肺癌［8］等惡性腫瘤發(fā)病及進(jìn)展。 有研究［9］顯示miR-527 可靶向硫酸酯酶2（sulfate 6-O-endosulfatase，SULF2）下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smad 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。 此外，還有研究證實(shí)SULF2 在HCC 組織中表達(dá)上調(diào)［10］。多數(shù)研究已表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與化療藥物耐藥有關(guān)［11-12］。 本研究通過(guò)分析HCC 患者TACE 治療前、后miR-527 與預(yù)后的關(guān)系，以期為T(mén)ACE 精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 前瞻性選取2015 年3 月至2017年4 月在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的168例HCC 患者作為研究對(duì)象。 根據(jù)《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專(zhuān)家共識(shí)》［13］診治HCC。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70 歲；②臨床資料完整；③接受TACE 治療；④Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)或B 級(jí)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)計(jì)生存時(shí)間短于3 個(gè)月； ②有TACE 治療禁忌證；③HCC 復(fù)發(fā)再次治療患者；④隨訪(fǎng)失聯(lián)；⑤不能配合完成研究所需檢查。 168 例HCC 患者中男113 例，女55 例，年齡39～70（61.6±5.3）歲；Child-Pugh 分級(jí)A 級(jí)126 例，B 級(jí)42 例； 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原（HBsAg）陽(yáng)性29 例；AFP＞400 μg/L 96 例；腫瘤直徑＞5 cm 87 例；腫瘤單發(fā)63 例，多發(fā)105 例；腫瘤分期Ⅰb 期17 例，Ⅱ期77 例，Ⅲa 期74 例。 本研究所有患者均簽署了知情同意書(shū)，本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 信息收集 收集HCC 患者年齡、 性別、Child-Pugh 分級(jí)、HBsAg、AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤分期及索拉非尼服用情況等資料。 采用電話(huà)隨訪(fǎng)或復(fù)診等方式了解HCC 患者預(yù)后情況，于患者出院后1 個(gè)月開(kāi)始隨訪(fǎng)，首次隨訪(fǎng)采用復(fù)診形式，之后每3 個(gè)月隨訪(fǎng)1 次，末次隨訪(fǎng)時(shí)間為2020 年4 月20 日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為36（6～36）個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 TACE 治療方案 TACE 術(shù)前檢查患者血、尿、糞便常規(guī)，心電圖，肝、腎功能及凝血功能等。 患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，行局部麻醉，由股動(dòng)脈入路置入導(dǎo)管鞘至腹腔動(dòng)脈或肝總動(dòng)脈，行血管造影，明確腫瘤供血?jiǎng)用}。 將稀釋好的藥物（奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶）緩慢灌注至腫瘤供血?jiǎng)用}，然后用超液化碘油和阿霉素充分乳化的混懸液進(jìn)行栓塞，然后注入明膠海綿懸浮液充分栓塞。 最后拔出導(dǎo)管和導(dǎo)管鞘，包扎傷口。 TACE 術(shù)后密切觀察患者，了解有無(wú)發(fā)熱、惡心、嘔吐、出血及并發(fā)癥等，若出現(xiàn)上述癥狀，給予針對(duì)性治療［14］。

1.2.2 miR-527 水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法［15］檢測(cè)HCC 患者血漿miR-527 水平。 抽取接受TACE 治療當(dāng)天及術(shù)后4 周時(shí)HCC 患者肘部靜脈血10 mL，室溫下以3 000 轉(zhuǎn)/min 轉(zhuǎn)速離心15 min（離心半徑10 cm），提取血漿，并將其保存在-80℃冰箱中。 將TRIzol 試劑（德國(guó)羅氏診斷有限公司，貨號(hào)：11667165001）加至裝有血漿的EP 管中提取總RNA，檢測(cè)總RNA 純度（A260/A280=1.8～2.1）后將其加至逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)羅氏診斷有限公司，貨號(hào)：5091284001）中獲取cDNA，最后用定量PCR 儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司，LightCycler 96 型）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃5 min，95℃40 s，57℃40 s，72℃40 s，35 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為U6。采集了30 例年齡、性別與之匹配的健康體檢者血液樣本，取其血漿miR-527 表達(dá)平均值作為校正對(duì)照。miR-527 序列F：5’-CTCAAGCTGTGACTGCAAAGG -3’，R：5’- CCAAA GGGAAGCACT-3’；U6 序列F：5’-CTCG-CTTCGGC AGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3’。 △Ct=CtmiR-527-CtU6，用2-DDct 計(jì)算miR-527水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，TACE 治療前、后miR-527 水平比較采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例或率［n（%）］表示。用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）評(píng)價(jià)miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的效能。用Kaplan-Meier 繪制生存曲線(xiàn)，并用Log-Rank 法比較差異。 用COX 回歸分析影響HCC 患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。 用R 3.6.3 軟件擬合限制性立方樣條和COX回歸分析miR-527 與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系。

圖1 患者入組及課題設(shè)計(jì)流程圖

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-527 水平比較

168 例HCC 患 者3 年 生 存 率 為67.9%（114/168）。 根據(jù)HCC 患者生存預(yù)后情況將其分為生存組（n=114）和死亡組（n=54）。 兩組術(shù)后miR-527 水平均高于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 生存組術(shù)后miR-527 水平高于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 miR-527 評(píng)價(jià)HCC 患者預(yù)后的價(jià)值

術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)下面積（AUC）、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.839（95%CI：0.775～0.891）、1.60、74.07%和84.21%。 術(shù)前miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的ROC AUC、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.519（95%CI：0.440～0.596）、1.04、63.0%和46.5%。 術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的效能高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=4.982，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 miR-527 評(píng)價(jià)HCC 患者預(yù)后的ROC 曲線(xiàn)

2.3 兩組生存情況比較

以術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)將HCC 患者分為高miR-527 組（n=110）和低miR-527 組（n=58）。 高miR-527 組中位生存時(shí)間高于低miR-527 組（36 個(gè)月比16 個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank χ2=74.740，P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 兩組生存曲線(xiàn)

2.4 影響HCC 患者預(yù)后的因素

將預(yù)后作為因變量，將HCC 患者年齡、性別、Child-Pugh 分級(jí)、HBsAg、AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤分期、索拉非尼和miR-527（TACE 術(shù)后）作為自變量分別納入COX 單因素，結(jié)果顯示Child-Pugh分級(jí)、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期和miR-527 與HCC患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。 按P≤0.1 標(biāo)準(zhǔn)，將Child-Pugh 分級(jí)、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期、索拉非尼和miR-527 作為自變量納入COX 多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤分期是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），索拉非尼和miR-527 是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 影響HCC 患者預(yù)后的COX 回歸分析

2.5 miR-527 與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系

用限制性立方樣條擬合COX 回歸分析miR-527 與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)比較不同節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)所對(duì)應(yīng)的AIC 值，最終確定節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為3 時(shí)AIC值最?。ˋIC=460.397）。 分析結(jié)果表明miR-527 與HCC 患者預(yù)后有關(guān)（χ2=80.55，P＜0.001），且呈線(xiàn)性關(guān)系（非線(xiàn)性檢驗(yàn)χ2=2.32，P=0.128）。 以術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)為參考點(diǎn)，miR-527＜1.60 時(shí)，與miR-527=1.60 比較，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高；當(dāng)miR-527＞1.60 時(shí)，與miR-527=1.60 比較，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)低，見(jiàn)圖4。

圖4 miR-527 與HCC 患者預(yù)后的限制性立方樣條圖

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多研究表明miRNA 與HCC 患者預(yù)后有關(guān)，如miR-187-3p 在HCC 組織中低表達(dá)，并可反映HCC 患者預(yù)后［16］；外泌體miR-224 表達(dá)水平高的HCC 患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高［17］。 目前，鮮有關(guān)于miR-527 與HCC 患者預(yù)后的研究。 現(xiàn)有研究表明miR-527 可靶向SULF2 下調(diào)TGF-β/Smad 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］。 已知上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的靈敏度，是化療耐藥的主要原因之一［18］。 基于上述研究，推測(cè)miR-527 可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響TACE 治療療效。 本研究通過(guò)比較TACE 治療前、后HCC 患者血漿miR-527 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組（死亡組和生存組）術(shù)后血漿miR-527 水平均升高，且生存組血漿miR-527 水平高于死亡組，上述結(jié)果表明miR-527 可能與HCC 患者預(yù)后有關(guān)，檢測(cè)其水平或可評(píng)估HCC 患者預(yù)后。

目前，已有多宗研究表明HCC 組織中蛋白或基因表達(dá)水平可反映患者預(yù)后，如磷脂酶Cβ1（phospholipase Cβ1，PLCβ1）在HCC 組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平升高增加患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)［19］。 此外，還有研究表明CC 趨化因子受體1（C-C motif chemokine receptor 1，CCR1）在肝癌組織中高表達(dá)，檢測(cè)其表達(dá)水平可反映患者生存預(yù)后［20］。 然而，上述研究均檢測(cè)的腫瘤組織中的蛋白表達(dá)水平，在取材上不具便利性，不適用于未經(jīng)手術(shù)治療的HCC 患者。 本研究采用血清學(xué)指標(biāo)miR-527 評(píng)價(jià)HCC 患者預(yù)后，經(jīng)ROC 曲線(xiàn)評(píng)價(jià)診斷效能，結(jié)果顯示術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的ROC AUC、 靈敏度和特異度分別為0.839、74.07%和84.21%，該結(jié)果表明術(shù)后miR-527 診斷HCC 患者預(yù)后的效能較高，可輔助評(píng)價(jià)HCC 患者預(yù)后。

既往研究表明腫瘤分期和服用索拉非尼可改善HCC 患者預(yù)后。 鄭家平等［21］研究表明肝功能良好的HCC 患者TACE 后服用索拉非尼可獲得較長(zhǎng)的生存時(shí)間和疾病穩(wěn)定狀態(tài)；Huo 等［22］研究證實(shí)HCC 分期越低患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)越低。本研究采用COX 回歸分析影響HCC 患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示腫瘤分期是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，索拉非尼是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，與上述研究結(jié)果一致。 此外本研究結(jié)果還顯示miR-527 是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，此外，限制性立方樣條分析結(jié)果還顯示當(dāng)miR-527＜1.60 時(shí)，與miR-527=1.60 比較，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高；當(dāng)miR-527＞1.60時(shí)，與miR-527=1.60 比較，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)低。推測(cè)其原因可能是高miR-527 水平抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的效果更強(qiáng)，檢測(cè)其水平可反映HCC 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度，進(jìn)而反映TACE 治療效果，但關(guān)于其病理生理機(jī)制仍有待開(kāi)展基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

本研究仍存在一定不足：樣本例數(shù)偏小，且為單中心研究，在樣本選擇上存在一定偏倚，下一步將增加樣本量，開(kāi)展多中心研究，驗(yàn)證本研究結(jié)果。綜上所述，HCC 患者TACE 后血漿miR-527 水平升高。 TACE 后血漿miR-527 水平與HCC 患者預(yù)后有關(guān)。 TACE 后血漿miR-527 水平低提示HCC 患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高。