何達(dá)東,陳凱奇,陳敬恒

(廣東省廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院,廣東 廣州511400)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是中老年女性常見的代謝性骨病,絕經(jīng)后女性雌激素水平下降,骨含量丟失,骨脆性和骨折風(fēng)險增加,嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松性骨折可伴有肺栓塞、重癥肺炎等,危及患者的生命,增加家庭與社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。PMOP歸屬于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇,病機(jī)總屬腎精虧虛,結(jié)合腎藏精、主骨生髓理論,臨床常以補(bǔ)腎填精法為主要治則[3]。金匱腎氣丸出自《金匱要略》,由茯苓、附子、桂枝、牡丹皮、山藥、山茱萸、熟地黃、澤瀉組成,功擅補(bǔ)腎填精、溫陽化氣,主治腎陽虛病證。多項研究表明,金匱腎氣丸治療PMOP具有良好療效[4-5]。但關(guān)于該藥物的作用機(jī)制目前尚不明確。借助系統(tǒng)生物學(xué)理論方法,篩選中藥方劑中的有效活性成分并預(yù)測其作用靶點,有助于深入理解中醫(yī)藥治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。本研究通過篩選、預(yù)測金匱腎氣丸組方中各中藥的有效活性成分及其治療PMOP的靶點基因,探索該藥物治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ),以期為后續(xù)研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 金匱腎氣丸 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集金匱腎氣丸組成藥物的活性成分,以口服生物利用度(OB)＞30%、類藥性(DL)＞0.18為口服中藥的有效活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。分別整理各單味藥的有效活性成分及對應(yīng)的疾病靶點。

1.2 PMOP治療靶點收集 人類基因組數(shù)據(jù)庫Gene Cards(https://www.genecards.org)與毒理學(xué)比較數(shù)據(jù)庫CTD(http://ctdbase.org/)是目前國際較為公認(rèn)的收錄人類疾病治療靶點的綜合數(shù)據(jù)庫。以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞在上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,分別下載、整理靶點數(shù)據(jù),與金匱腎氣丸有效活性成分對應(yīng)的疾病靶點互相映射,獲得金匱腎氣丸有效活性成分防治PMOP的疾病靶點。

1.3 目標(biāo)靶點蛋白互作分析與關(guān)鍵靶點篩選 靶點基因翻譯的蛋白質(zhì)是靶點基因執(zhí)行生物學(xué)功能的物質(zhì)信息,不同蛋白質(zhì)之間存在互相作用的關(guān)系,如協(xié)同、拮抗、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種方式。蛋白互作(PPI)分析有助于發(fā)現(xiàn)基因間的關(guān)聯(lián)性并進(jìn)一步進(jìn)行針對性研究。將獲得的金匱腎氣丸防治PMOP的靶點基因上傳至在線蛋白互作分析工具STRING(https://string-db.org/),選擇物種為“homo sapiens”,最小互作分值＞0.4,運行目標(biāo)靶點基因的蛋白互作分析,下載保存結(jié)果。將結(jié)果導(dǎo)入生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析工具Cytoscape軟件,構(gòu)建目標(biāo)靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),根據(jù)各靶點基因在網(wǎng)絡(luò)中的連接度進(jìn)行關(guān)鍵靶點的篩選。

1.4 中藥-有效活性成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 整理前述獲得的金匱腎氣丸藥物組成、篩選的有效活性成分及與其存在直接作用關(guān)系的PMOP治療靶點,導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建中藥-有效活性成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò),整體分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò),疏理金匱腎氣丸防治PMOP的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸組方有效活性成分及其疾病靶點將金匱腎氣丸組方中的8味中藥分別輸入TCMSP中,根據(jù)OB＞30%、DL＞0.18的藥動學(xué)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,最終獲得有效活性成分茯苓6個、附子6個、桂枝5個、牡丹皮6個、山藥12個、山茱萸12個、熟地黃2個、澤瀉7個。排除不同藥物間重復(fù)的有效活性成分,最終獲得金匱腎氣丸有效活性成分47個,對應(yīng)的治療靶點105個。

2.2 金匱腎氣丸治療PMOP的目標(biāo)靶點 從Gene Cards及CTD數(shù)據(jù)庫檢索獲得PMOP治療靶點分別為1 073個與12 385個,與上述獲得的105個金匱腎氣丸治療靶點互相映射,最終獲得金匱腎氣丸治療PMOP的目標(biāo)靶點60個,可以認(rèn)為金匱腎氣丸的有效活性成分即是通過對此60個目標(biāo)靶點所參與的生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而發(fā)揮其治療PMOP的作用。

2.3 目標(biāo)靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點 將獲得的60個金匱腎氣丸治療PMOP的目標(biāo)靶點基因整理上傳至STRING網(wǎng)站,運行蛋白互作PPI分析,將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建目標(biāo)靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并使用Cytohubba插件進(jìn)行各靶點基因在網(wǎng)絡(luò)中的連接度Degree值計算,篩選其中Degree值最高的前10位靶點基因,結(jié)果見圖1。如圖A所示,目標(biāo)靶點基因間存在較密切的互作關(guān)系,共同構(gòu)成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)各目標(biāo)靶點與其他靶點基因之間的連接關(guān)系計算其連接度Degree值,排名最高的前10位靶點基因為IL6(48)、ESR1(39)、VEGFA(39)、EGFR(39)、MYC(38)、MAPK8(37)、CASP3(36)、CCND1(35)、AR(32)及PPARG(30)。這10個靶點基因在目標(biāo)靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中與眾多靶點存在連接作用,是金匱腎氣丸治療PMOP的關(guān)鍵靶點,可能參與重要的生物學(xué)功能活動。

圖1 目標(biāo)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 中藥-有效活性成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 整理金匱腎氣丸組方中的8味中藥、篩選獲得的47個有效活性成分及60個對應(yīng)的PMOP目標(biāo)靶點,導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建中藥-有效活性成分-目標(biāo)靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖2。金匱腎氣丸中的8味中藥與篩選獲得的47個有效活性成分之間以邊線相連,牡丹皮、山藥、山茱萸等與較多的有效活性成分相連,與其篩選獲得較多有效活性成分的結(jié)果相對應(yīng),活性成分與目標(biāo)靶點之間形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療作用的多成分、多靶點、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)作用特點。

圖2 金匱腎氣丸-有效活性成分-目標(biāo)靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

人類生長發(fā)育依賴于腎精的充養(yǎng),《素問·上古天真論》言:“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長……四七,筋骨堅……七七,任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也?！笨梢哉J(rèn)為腎精即是人體生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ),女性絕經(jīng)后腎精虧虛,故而出現(xiàn)PMOP。中醫(yī)藥治療PMOP當(dāng)以補(bǔ)腎填精為根本大法。金匱腎氣丸具有補(bǔ)腎、益精、溫陽之功,廣泛應(yīng)用于治療腎陽虛型PMOP,但該藥物是如何發(fā)揮其治療作用目前仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)合中醫(yī)辨證論治觀點與現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)理論方法,借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析工具TCMSP網(wǎng)站篩選金匱腎氣丸組方中的有效活性成分,同時借助Gene Cards、CTD等人類疾病基因數(shù)據(jù)庫獲得PMOP的疾病靶點基因,經(jīng)過互相映射,最終獲得金匱腎氣丸治療PMOP的有效活性成分及與其作用的靶點基因。中藥有效活性成分是中藥經(jīng)口服被人體吸收后真正發(fā)揮藥理學(xué)作用的物質(zhì),是發(fā)揮中藥治療作用的基礎(chǔ)物質(zhì)；而疾病靶點基因則是藥物直接作用的靶點,靶點基因所參與的生物學(xué)過程、所在的信號通路,以各不相同的靶點基因攜帶、轉(zhuǎn)導(dǎo)、完成相應(yīng)生命活動所需的遺傳信息。病理情況下相應(yīng)靶點基因的生物學(xué)功能活動發(fā)生異常,需要針對靶點基因進(jìn)行調(diào)控,以恢復(fù)正常生理學(xué)功能。中藥的有效活性成分與相應(yīng)疾病靶點基因是中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ),其治療作用是基于活性成分調(diào)控疾病靶點基因的生物學(xué)功能實現(xiàn)的。

本研究針對獲得的PMOP治療靶點,進(jìn)行了目標(biāo)靶點的蛋白互作分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。從PPI網(wǎng)絡(luò)可知,PMOP疾病靶點之間存在較為密切的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò),各靶點間連接廣泛,提示PMOP的發(fā)生是由多靶點共同調(diào)控,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選獲得的IL6、ESR1、AR、MAPK8等關(guān)鍵靶點,共同參與機(jī)體的雌激素受體活動、雄激素受體活動、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、破骨細(xì)胞分化等生物學(xué)活動或通路機(jī)制[9-11]。上述靶點是與PMOP發(fā)病過程中骨重建-骨吸收穩(wěn)態(tài)調(diào)控存在直接關(guān)聯(lián)作用的重要靶點。從金匱腎氣丸-有效活性成分-PMOP目標(biāo)靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可知,金匱腎氣丸對PMOP的治療存在多成分、多靶點、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的作用特點,這與中醫(yī)藥從整體及發(fā)病之本進(jìn)行治療的理念相符。

綜上所述,本研究初步明確了金匱腎氣丸中的有效活性成分及其作用靶點,但各靶點基因參與的具體生物學(xué)過程及其在各種通路機(jī)制中發(fā)揮的作用目前尚不明確；另一方面,金匱腎氣丸發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)(組方中的有效活性成分),在目標(biāo)靶點參與的生物學(xué)過程中是如何進(jìn)行調(diào)控的,也仍需進(jìn)一步探索。