楊莉?qū)?黑嘉慧,成 昭,苗延青

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西航天職工大學(xué)，陜西 西安 710100)

甲硝唑 (Metronidazole，MTZ)具有廣譜抗厭氧菌和抗原蟲(chóng)的作用，臨床主要用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，是硝基咪唑類的代表性藥物[1-2]。其抗厭氧菌的作用機(jī)理為，在厭氧細(xì)胞內(nèi)甲硝唑被還原為中間活性物，該中間物與細(xì)菌內(nèi)的DNA作用，使DNA螺旋結(jié)構(gòu)斷裂，破壞微生物正常的新陳代謝而致細(xì)胞死亡[3-4]。近年來(lái)報(bào)道甲硝唑在臨床上存在著耐藥性和不良反應(yīng)，對(duì)甲硝唑進(jìn)行修飾，增強(qiáng)其抗菌作用，減少不良反應(yīng)，是藥物化學(xué)領(lǐng)域一個(gè)熱門(mén)課題。

許多金屬離子與藥物結(jié)合，能增強(qiáng)藥物的抗菌能力，有報(bào)道甲硝唑金屬配合物通過(guò)甲硝唑與金屬離子的協(xié)同作用表現(xiàn)較強(qiáng)的抗菌活性[5]。而金屬錳在生物學(xué)中作為酶的激活劑和必需輔助因子具有許多重要作用，尤其對(duì)骨骼發(fā)育、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、線粒體氧化還原和細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[6]。多項(xiàng)體外研究表明Mn 與DNA、RNA 和核糖體結(jié)合導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯失調(diào)[7]。近年來(lái)，Mn(II) 作為一種能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的新型金屬元素引起了廣泛關(guān)注[8]。

Scheme 1

研究表明甲硝唑的一些過(guò)渡金屬配合物較甲硝唑具有良好的體外抗革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的性能[9]，而關(guān)于甲硝唑錳配合物和DNA相互作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。以甲硝唑與醋酸錳(Ⅱ)為原料，合成甲硝唑的錳 (Ⅱ)配合物，并通過(guò)元素分析、IR、UV-Vis、電導(dǎo)率、熱失重等方法對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，研究了配合物與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用方式，希望為進(jìn)一步探討甲硝唑金屬藥物的抗菌機(jī)理提供參考信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Vario EL-IIIG型元素分析儀；EQUINOX55 型紅外光譜儀；800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Ubbeoldhe型粘度計(jì)；DDS-307型電導(dǎo)率儀。

甲硝唑 (原料藥,陜西省藥檢所)，小牛胸腺DNA(生化試劑，Sigma公司)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 配合物的合成

分別稱取甲硝唑0.342g(2 mmol)溶解于15 mL甲醇中，醋酸錳[Mn(AcO)2·4H2O)] 0.245g(1 mmol)溶解于10 mL甲醇中，將甲硝唑溶液緩慢加入到醋酸錳溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h，過(guò)濾靜置，室溫下?lián)]發(fā)溶劑。20 d后有紅棕色黏稠物生成，加入無(wú)水乙醚形成土色沉淀，過(guò)濾，濾餅用無(wú)水乙醚洗滌、干燥得淡棕色粉末狀固體，產(chǎn)率75%(以Mn計(jì))。

1.3 配體及其配合物與DNA相互作用

與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)所需試劑的配制及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作按照文獻(xiàn)[10-11]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的結(jié)構(gòu)表征

(1) 元素分析和摩爾電導(dǎo)率

表1的數(shù)據(jù)表明配合物元素分析的實(shí)驗(yàn)值與理論值較為一致，基本可以確定其化學(xué)組成。根據(jù)摩爾電導(dǎo)率值可以判斷配合物在甲醇中屬于非電解質(zhì)[12]。

表1 配合物的元素分析及摩爾電導(dǎo)率Table 1 Element analysis and molar conductivity data of complex

(2) IR

當(dāng)甲硝唑配體形成金屬配合物以后,有些特征吸收峰發(fā)生了一定程度的偏移，其中咪唑環(huán)上的ν(C=N)伸縮振動(dòng)由1536 cm-1向高波數(shù)1541 cm-1發(fā)生了偏移,說(shuō)明金屬與咪唑環(huán)上的3-N發(fā)生了配位[13]，而位于指紋區(qū)的445 cm-1吸收峰可以指派為配位鍵ν(Mn—N)。硝基的伸縮振動(dòng)ν(NO2)吸收峰變化不大，說(shuō)明硝基未參與配位[14]。與配體相比，配合物中含有CH3COO-，其νas(COO-) 和νs(COO-)分別為1566 cm-1，1360 cm-1，Δνas(COO-)-νs(COO-)值為206 cm-1，這與文獻(xiàn)報(bào)道[15]的醋酸根對(duì)稱橋連配位模式的紅外吸收峰情況基本一致，說(shuō)明醋酸根可能與兩個(gè)Mn原子橋連配位[16]。同時(shí)配合物在3400 cm-1處有一寬峰，表明有水參與配位[17]。

(3) UV-Vis

由圖1可見(jiàn)，配體在200～400 nm范圍內(nèi)有兩個(gè)主要吸收峰分別位于240 nm和320 nm處，可分別歸屬為有機(jī)配體咪唑環(huán)共軛體系的π→π*和n→π*電子躍遷。和配體相比，配合物在240 nm處的吸收發(fā)生了紫移，出現(xiàn)在230 nm處，并且紫外吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這是金屬M(fèi)n(Ⅱ)離子與配體發(fā)生配位的結(jié)果。

λ/nm圖1 配體L和配合物的UV-Vis譜圖Figure 1 The UV-Vis spectru of Ligand and complex

(4) TGA

由圖2可見(jiàn)配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O熱分解過(guò)程大致有4步。首先在68～188 ℃表現(xiàn)兩個(gè)吸熱過(guò)程，TG曲線坍塌失重12.89%，該失重的兩個(gè)吸熱過(guò)程是配合物逐步失去6個(gè)結(jié)晶水分子(失重理論值為12.98%)所致。第二步的熱分解溫度區(qū)間為189～240 ℃，DSC表現(xiàn)出有一個(gè)放熱峰和一個(gè)吸熱峰，TG曲線顯示失重18.87%，該過(guò)程是配合物受熱失去兩個(gè)配位水分子和兩個(gè)醋酸根離子所致(失重理論值為18.52%)。第三步的熱分解溫度區(qū)間為190～325 ℃，DSC曲線顯示吸熱過(guò)程的峰頂溫度為305 ℃，失重率為20.20%，對(duì)應(yīng)于失去一個(gè)甲硝唑分子(失重理論值為20.56%)。第四步配合物失去最后一個(gè)甲硝唑配體分子(失重率理論值20.56%)，熱分解溫度區(qū)間位于326～830 ℃，在813 ℃有一弱的放熱過(guò)程，失重率21.52%，隨著連續(xù)加熱配合物不斷失重，當(dāng)加熱至1000 ℃時(shí)殘余物為黑色，含量20.66%，與生成MnO2的理論殘余量20.91%相近。

Temperature/℃圖 2 配合物的TGA曲線圖Figure 2 TGA curves of complex

2.2 配合物結(jié)構(gòu)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O的結(jié)構(gòu)如Chart 1所示。

Chart 1

2.3 配合物與ct-DNA的相互作用

(1) 甲硝唑及其配合物與DNA相互作用的UV-Vis

由圖3可見(jiàn)，在320 nm左右甲硝唑配體及配合物均有紫外最大特征吸收峰，為甲硝唑分子內(nèi)π→π*的電子躍遷吸收。配體及配合物的紫外特征吸收峰隨著DNA的不斷加入都表現(xiàn)出顯著的減色效應(yīng)(0.95→0.91，2.15→2.07)，表明配合物與DNA發(fā)生了鍵合作用[18-19]。

(2) 甲硝唑及其配合物與 ct-DNA 相互作用的熒光光譜

圖4表明甲硝唑配體及其配合物的熒光強(qiáng)度隨著DNA濃度的增大均表現(xiàn)出顯著的增色效應(yīng)，甲硝唑的熒光強(qiáng)度增幅大于配合物。化合物熒光強(qiáng)度增加，究其原因可能是甲硝唑及其配合物插入或部分插入DNA分子所致。因?yàn)楫?dāng)化合物插入剛性比較強(qiáng)的DNA分子時(shí)，DNA能夠很好地保護(hù)化合物發(fā)光，這與己知的一些插入試劑在DNA存在時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象一致[20-22]。

λ/nm

(3) 甲硝唑及其配合物與 ct-DNA 相互作用的黏度

具有光學(xué)活性的光物理探針對(duì)于探討鍵合模式一般可以提供必要的但不是充分的證據(jù)[23]。沒(méi)有晶體數(shù)據(jù)時(shí)，一般認(rèn)為確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一是物質(zhì)黏度的變化，分子長(zhǎng)度的變化對(duì)物質(zhì)黏度的影響非常大[24]。若化合物以經(jīng)典插入方式與DNA相互作用，DNA相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)變大，DNA螺旋拉長(zhǎng)，導(dǎo)致DNA黏度增加。若DNA溶液的黏度幾乎不變，則化合物與DNA相互作用是以非插入方式(靜電、溝槽結(jié)合等)進(jìn)行的。DNA的黏度如果減小，則化合物以部分插入方式與DNA作用，這時(shí)DNA的雙螺旋可能發(fā)生扭結(jié)或彎曲導(dǎo)致黏度減小[25-27]。因而，需用黏度法對(duì)光譜法得到的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以便較為準(zhǔn)確的判斷化合物與DNA的鍵合模式。

λ/nm

由圖5可以看出，DNA溶液的黏度隨各物質(zhì)濃度的增加而增大，配體L對(duì)DNA溶液黏度的影響更大。黏度分析的結(jié)果表明配體及配合物均以插入方式與DNA相互作用，由于甲硝唑配體分子的平面性強(qiáng)于配合物，配體與DNA的相互作用力較大，這與光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

Ccompound/CNDA圖 5 配體L及其配合物濃度對(duì)DNA粘度的影響Figure 5 Effects of increasing amount of L and complex on the viscosity of DNA

合成了甲硝唑的Mn(Ⅱ) 配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O，利用元素分析、紫外光譜、紅外光譜、摩爾電導(dǎo)率、熱重分析等分析方法確定了產(chǎn)物可能是一個(gè)醋酸根橋連的二核金屬配合物。并通過(guò)紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度法研究了甲硝唑配體及其錳配合物與 ct-DNA的相互作用，綜合分析光譜法和黏度法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為配體及其錳配合物與 ct-DNA之間可能以經(jīng)典的插入式相互作用，由于甲硝唑配體分子結(jié)構(gòu)的平面性較配合物更好，配體與ct-DNA的相互作用強(qiáng)于配合物。