王彥平，婁芳慧，孫瑞琳，錢志偉*，湯高奇

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州 451450）

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種多酚類化合物，結(jié)構(gòu)中含有芪類，在葡萄皮中其含量最高[1-2]。白藜蘆醇的生理功能有很多，其中在腫瘤的抑制、血糖的調(diào)控、心腦血管的防護、抗氧化、衰老的延緩等方面尤其突出[3-10]。赤霞珠釀酒葡萄皮渣中含有豐富的白藜蘆醇、原花青素、花青素、類黃酮等生理活性物質(zhì)[11]，但一般被當(dāng)作飼料、肥料，甚至被當(dāng)作廢料舍棄，其中所含有的多種有效成分未被利用，既造成了環(huán)境污染又浪費資源。白藜蘆醇的浸提方式有很多，常用的有有機溶劑浸提法、超聲波浸提法、微波浸提法、酶水解法等[12-16]。本試驗在傳統(tǒng)有機溶劑浸提法的基礎(chǔ)上，使用雙酶法（纖維素酶和果膠酶）輔助浸提并優(yōu)化工藝參數(shù)，并測定該條件下所得白藜蘆醇的體外抗氧化活性，以期為赤霞珠釀酒葡萄皮渣的高效應(yīng)用開拓新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠釀酒葡萄皮渣：2019年河南省農(nóng)業(yè)高新科技園。置于恒溫箱中于45 ℃烘干48 h，粉碎后過50目篩，用索氏浸提器加入乙醚進行脫脂處理，封存待用。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫科技公司；BSA423S-CW分析天平：德國賽多利斯集團；JY-5002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司；XZ-5MT離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；GWB-1E試驗室專用超純水機：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙酶法輔助浸提白藜蘆醇

準確稱取5 g赤霞珠釀酒葡萄皮渣粉末至250 mL錐形瓶中，加入適量纖維素酶、果膠酶和50 mL超純水，搖勻，調(diào)整pH至5.0，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下水解，然后按照適當(dāng)?shù)囊汗瘫燃尤塍w積分數(shù)95%的乙醇，搖勻，75 ℃水浴浸提4 h。浸提液6 000 r/min離心15 min，上清液減壓蒸餾后用體積分數(shù)95%的乙醇定容至25 mL。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

設(shè)定纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、0.4%，酶解條件為45 ℃、120 min，液固比（乙醇∶葡萄皮渣）25∶1（mL∶g）為基本條件。分別改變纖維素酶添加量為0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；果膠酶添加量為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%；酶解時間為40 min、60 min、80 min、100 min、120 min；酶解溫度為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃；液固比（乙醇∶葡萄皮渣）為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g），以白藜蘆醇得率為考察指標，研究各因素對赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇工藝的影響。

1.3.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平L9（34）正交試驗確定雙酶法浸提赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的最佳工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

經(jīng)患者肘前靜脈用裝有5 ml枸櫞酸鈉抗凝劑的50 ml的一次性注射器抽取45 ml靜脈血，搖勻后注入PRP套裝離心管中，在嚴格無菌狀態(tài)下以2 000 r/min離心2次，每次10 min，最后用無菌吸引管抽取最下層血漿約10 ml，即富血小板血漿備用。使用穿刺針將制備好的PRP注入膝關(guān)節(jié)腔（穿刺過程嚴格無菌操作），每一側(cè)注射量為3～4 ml（量多了局部有疼痛感），連續(xù)注射3次，每次間隔一周，術(shù)后輔以全面系統(tǒng)化的護理和康復(fù)鍛煉，患者均于術(shù)后1個月、2個月、3個月復(fù)查膝關(guān)節(jié)磁共振了解膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨情況。

表1 赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇浸提工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for resveratrol extraction process optimization from Cabernet Sauvignon wine residue

1.3.4 測定方法

白藜蘆醇的標準曲線繪制及得率測定：準確稱取白藜蘆醇標準品（干燥至恒質(zhì)量）20 mg，使用甲醇-水溶液（60∶40，V/V）溶解并定容至10 mL，搖勻配制成2 mg/mL的白藜蘆醇儲備液，4 ℃冰箱保存。分別量取定量的標準品儲備液配制成質(zhì)量濃度分別為2.5μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的白藜蘆醇溶液。采用HPLC法[17]測定，得回歸方程：y=150 766x+509 796，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

稱量5份5 g赤霞珠釀酒葡萄皮渣粉，按最佳浸提工藝浸提，將浸提液于離心機中6 000 r/min離心20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮之后將其定容至25 mL。依據(jù)1.3.1色譜條件檢測，從而進一步獲得赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇的得率，其計算公式如下：

赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率（μg/g）=白藜蘆醇質(zhì)量（μg）/赤霞珠釀酒葡萄皮渣粉末質(zhì)量（g）

赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇的體外抗氧化活性：最佳條件下得到的赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇浸提液，參照文獻[18-19]的方法分別測定其DPPH自由基（DPPH·）清除率、羥基自由基（·OH）清除率，并以維生素C（vitamin C，VC）作陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對白藜蘆醇浸提工藝的影響

圖1 纖維素酶添加量對白藜蘆醇得率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the yield of resveratrol

從圖1可以看出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率隨著纖維素酶添加量的增加呈先升高后趨于平緩的趨勢。纖維素酶添加量為2.0%時，白藜蘆醇的得率到達最高值，為（861.4±6.71）μg/g；纖維素酶添加量為2.5%時，白藜蘆醇的得率與0.20%樣品組無明顯差異（P＞0.05）。故選擇纖維素酶添加量為1.5%～2.5%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 果膠酶添加量對白藜蘆醇得率的影響

圖2 果膠酶添加量對白藜蘆醇得率的影響Fig.2 Effect of pectase addition on the yield of resveratrol

從圖2可以看出，果膠酶添加量在0～1.6%試驗范圍內(nèi)，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的得率呈先上升后稍微下降的趨勢。果膠酶添加量為1.2%時，白藜蘆醇得率到達最高值，為（889.1±6.71）μg/g；果膠酶添加量為1.6%時，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率與1.2%樣品組無明顯差異（P＞0.05）。原因可能是酶濃度達到一定值后，底物濃度相對不能飽和，導(dǎo)致酶作用受阻[20]。同時，結(jié)果表明雙酶法浸提赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇得率高于單一纖維素酶浸提法得率（P＜0.05）。故選擇果膠酶添加量為0.8%～1.6%進行后續(xù)試驗。

2.1.3 酶解時間對白藜蘆醇得率的影響

圖3 酶解時間對白藜蘆醇得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield of resveratrol

從圖3可以看出，隨著酶解時間的延長，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率呈先升高后平穩(wěn)的趨勢。酶解時間為100 min時，白藜蘆醇得率達到較高值，為（881.5±5.73）μg/g；酶解時間延長至120 min時，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的得率略有上升，但與100 min樣品組無明顯差異（P＞0.05）。故選取酶解時間在80～120 min進行后續(xù)試驗。

2.1.4 酶解溫度對白藜蘆醇得率的影響

圖4 酶解溫度對白藜蘆醇得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of resveratrol

從圖4可以看出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率隨著酶解溫度的升高呈先升高后下降的趨勢。酶解溫度為45 ℃時，白藜蘆醇的得率達到最高值，為（891.9±4.98）μg/g；酶解溫度為50 ℃時，白藜蘆醇的得率與45 ℃樣品組無明顯差異（P＞0.05）；溫度升至55 ℃時，白藜蘆醇的得率與45 ℃樣品組有明顯差異（P＜0.05）?？赡苡捎谶^高的溫度可能導(dǎo)致酶的活性衰減，而使酶解反應(yīng)難以充分進行，試驗過程中獲得的白藜蘆醇得率也有一定程度的下降。故選擇酶解溫度為45～55 ℃進行后續(xù)試驗。

2.1.5 液固比對白藜蘆醇得率的影響

圖5 液固比對白藜蘆醇得率的影響Fig.5 Effect of liquid to solid ratio on the yield of resveratrol

從圖5可以看出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇得率隨著液固比的增加呈先升高后趨于平緩的趨勢。當(dāng)液固比為30∶1（mL∶g）時，白藜蘆醇得率達到最高值，為（896.7±4.66）μg/g。隨著液固比值的上升使得白藜蘆醇與溶劑的接觸面積增大，進而促使赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的溶出。液固比升高至35∶1（mL∶g），白藜蘆醇得率與30∶1（mL∶g）的樣品組相比無明顯差異（P＞0.05）。故選擇液固比為30∶1（mL∶g）進行后續(xù)試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果

表2 赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇浸提工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Result of orthogonal tests for resveratrol extraction process optimization from Cabernet Sauvignon wine residue

由表2可以看出，影響白藜蘆醇得率的4個因素大小依次為D＞A＞B＞C，即酶解溫度＞纖維素酶添加量＞果膠酶添加量＞酶解時間。最優(yōu)方案為A3B2C2D2，即纖維素酶添加量2.5%，果膠酶添加量1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解時間100 min。在此條件下赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇的平均得率為（927±4.11）μg/g。

2.3 赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的體外抗氧化活性

2.3.1 對DPPH·的清除作用

圖6 赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對DPPH·的消除作用Fig.6 Scavenging effect of resveratrol from Cabernet Sauvignon wine residue on DPPH free radical

由圖6可以看出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對DPPH·的半抑制濃度（50%inhibitory concen traton，IC50）值為0.164 mg/mL，VC的IC50值為0.224 mg/mL。赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對DPPH·的消除能力高于VC。

圖7 赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對OH·的消除作用Fig.7 Scavenging effect of resveratrol from Cabernet Sauvignon wine residue on OH free radical

2.3.2 對·OH的清除作用

由圖7可以看出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對·OH的IC50值為0.282 mg/mL，VC的IC50值為0.340 mg/mL。赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對·OH的消除能力高于VC。

3 結(jié)論

本研究以釀酒赤霞珠釀酒葡萄皮渣為原料，優(yōu)化了雙酶法（纖維素酶和果膠酶）輔助浸提赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的浸提工藝，得到的最佳工藝條件為：纖維素酶和果膠酶加入量分別為2.5%和1.2%，酶解時間100 min、酶解溫度45 ℃、液固比為30∶1（mL∶g）。在最優(yōu)條件下，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的得率是（927±4.11）μg/g，此結(jié)果要高于單一使用纖維素酶浸提法得率或者單一使用果膠酶浸提法得率。體外抗氧化試驗數(shù)據(jù)可以得出，赤霞珠釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇消除DPPH·和·OH的能力較高，其抗氧化作用也高于VC，并且抗氧化作用與白藜蘆醇的含量呈正相關(guān)，作為天然抗氧化物，值得進一步研究和開發(fā)。