周艷紅，郭昌明

（1.沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110034；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062）

豬流行性腹瀉病（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征的高度接觸性的豬腸道傳染病[1]。近幾年來，豬流行性腹瀉在我國冬春季節(jié)頻發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失[2-3]。在臨床上豬流行性腹瀉病與傳染性胃腸炎（TGE）以及豬輪狀?。℅AR）極為相似[4]，很難鑒別。現(xiàn)針對吉林省某養(yǎng)豬場病例，結(jié)合臨床進行實驗室科學(xué)檢查、鑒別，最終確診，為豬流行性腹瀉病的診斷及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2頭?。ㄋ溃┴i為吉林省某養(yǎng)豬場送檢的發(fā)病仔豬。無菌采取心血、心包積液、淋巴結(jié)和腸道等實質(zhì)器官用于病原分離與檢驗。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查與臨床癥狀收集

針對該疫病的暴發(fā)，進行實地流行病學(xué)調(diào)查和臨床觀察。流行病學(xué)調(diào)查的主要內(nèi)容包括：發(fā)病數(shù)量、豬群的免疫情況、發(fā)病情況、發(fā)病病程和治療情況、周圍地區(qū)發(fā)病情況等。同時現(xiàn)場觀察、記錄發(fā)病豬的臨床癥狀[5]。

1.3 病理剖檢

對送檢病死仔豬尸體進行病理剖檢，觀察該動物的皮膚顏色、口鼻肛門等天然孔變化，檢查口腔和眼黏膜、皮下、肌肉、主要淋巴結(jié)和體腔積液與滲出情況，檢查內(nèi)臟器官肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟的病變和胃腸內(nèi)容物性狀與胃腸道黏膜系統(tǒng)的病理變化，并做好記錄。同時，采取病料，保存于福爾馬林溶液中，進行病理組織學(xué)檢查病料。用于分子生物學(xué)檢查的病料，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 病理組織學(xué)檢查

病理組織切片的制作采用常規(guī)方法與程序，即甲醛溶液固定后的組織以梯度乙醇溶液脫水，之后以二甲苯溶液進行透明處理，浸蠟包埋。包被塊切片后按照先前報道方法進行HE染色與觀察[6]。

1.5 樣品處理

以滅菌的棉拭子采集病仔豬腸道內(nèi)容物，放入1 mL PBS 中（100 mmol/L PBS，pH 值7.2）4 ℃靜置15 min，然后8 000 r/min、4 ℃離心20 min。上清液分裝至Ep 管，每管0.5 mL，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

1.6 病毒感染細(xì)胞試驗（CPE）

腸內(nèi)容物用含1 000 IU/mL青霉素、1 000 μg/mL鏈霉素PBS 制成5 倍懸液，在4 ℃條件下3 000 r/min 離心30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，將過濾液大約為病毒培養(yǎng)液的10%接種于長滿Vero 細(xì)胞單層上，同時加過濾液量50%的病毒培養(yǎng)液，37 ℃吸附1 h，添加至病毒培養(yǎng)液總量，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)，逐日觀察3～4 d，對比CPE變化情況[7-8]。

1.7 總RNA提取

將上述處理好的病毒培養(yǎng)細(xì)胞液樣品進行處理，提取細(xì)胞總RNA。提取RNA鑒定后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

1.8 引物設(shè)計

依據(jù)GenBank 收錄的基因序列，分別設(shè)計豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒各1 對引物，共3 對特異引物[10]。按說明將引物稀釋到備用濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。所用引物由上海生工生物公司合成，引物序列見?。

1.9 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

提取RNA 按說明書進行cDNA 的合成。PCR 擴增參照TaKaRa 公司試劑說明書進行，總反應(yīng)體系為25 μL。PCR反應(yīng)程序為如下：94 ℃，5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃,30 s，共32個循環(huán)；72 ℃，10 min；PCR后的產(chǎn)物置于4 ℃。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖進行電泳分析鑒定。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病豬的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

吉林農(nóng)安養(yǎng)殖戶，養(yǎng)殖數(shù)量為100 頭仔豬，均為育肥用，日齡為60 d 左右。仔豬均從一家豬場購進，購進18 d后發(fā)病。幾乎全部發(fā)病，發(fā)病第4 d于2019年4月12日來門診就診。仔豬沒有接種過豬流行性腹瀉及豬傳染性胃腸炎疫苗。用大量抗生素治療無效，死亡7頭。發(fā)病前沒有更換飼料，近期氣候變化大。本地豬流行性腹瀉發(fā)病情況比較嚴(yán)重。

2.2 發(fā)病豬的臨床癥狀

患病豬主要表現(xiàn)為食欲減退、拉黃色水樣稀糞便、步態(tài)不穩(wěn)、被毛臟亂、精神狀態(tài)差、體溫稍高。時有糞便呈粥狀、或為灰白、淡黃、黃綠、?；煊叙ひ?，甚至黏膜或血液。脫水嚴(yán)重、眼球下陷、皮膚彈力下降、鼻鏡干燥等。

2.3 發(fā)病豬的剖檢病理變化（見圖1）

圖1 發(fā)病豬的剖檢病理變化Fig.1 Necropsy pathological changes of diseased pigs

由圖1可知，患病豬病理剖檢變化主要集中在小腸、結(jié)腸、盲腸有出血等變化。腸管擴張膨脹，腸壁菲薄透明，腸系膜充血、淤血、出血，外觀整個腸管呈紅紫色。腸系膜淋巴結(jié)水腫發(fā)白。

2.4 發(fā)病豬的組織病理學(xué)結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，小腸絨毛脫落嚴(yán)重，小腸絨毛萎縮、腸絨毛與腸腺長短比例由正常的7∶1 下降到3∶1 以下，腸壁血管淤血出血等。脾臟動脈周圍淋巴鞘增厚。腸系膜淋巴竇間隙增寬，水腫。

2.5 發(fā)病豬的CPE試驗結(jié)果（見圖3）

圖2 組織病理學(xué)結(jié)果Fig.2 Histopathological results

Vero細(xì)胞復(fù)蘇傳代后觀察正常形態(tài)，病毒感染后Vero細(xì)胞培養(yǎng)第40 h觀察細(xì)胞病變。由圖3可知，細(xì)胞表面粗糙、顆粒增多、有多細(xì)胞核細(xì)胞、可見空斑樣小區(qū)、細(xì)胞逐漸脫落。

圖3 CPE試驗結(jié)果Fig.3 Experimental result of CPE

2.6 病毒基因擴增與鑒定結(jié)果（見圖4）

圖4 RT-PCR凝膠鑒定結(jié)果Fig.4 Gel identification results

由圖4可知，用凝膠成像進行鑒定擴增片段大小，結(jié)果可見TGEV 和GARV 對應(yīng)引物沒有出來目的條帶，只有PEDV 引物出現(xiàn)790 bp 目的條帶。說明此次檢測樣品的PEDV病原為陽性。

3 討論

本試驗對吉林省某豬場暴發(fā)的一種臨床上以水樣腹瀉為主要臨床特征，發(fā)病率達(dá)100%。剖檢主要以小腸和結(jié)腸有出血、腸管擴張膨脹、腸壁菲薄透明、腸系膜充血、淤血、出血為病變特征的疫病進行深入研究。

通過病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)小腸絨毛脫落嚴(yán)重、小腸絨毛萎縮明顯、腸系膜淋巴結(jié)水腫間隙增寬等。病毒分離CPE 試驗結(jié)果提示，感染PEDV 的Vero 細(xì)胞表面粗糙、顆粒增多、細(xì)胞逐漸脫落。進一步RT-PCR 試驗鑒定結(jié)果顯示，PEDV 引物出現(xiàn)790 bp 目的條帶，而TGEV 和GARV 對應(yīng)引物沒有出來目的條帶，可確定PEDV 病原為陽性。所以，此次疫情是豬感染PEDV引起的豬流行性腹瀉疫病。由此可見，病原的分離鑒定是實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

此病案發(fā)病在春季4月份，仔豬以水樣腹瀉為主、脫水嚴(yán)重、發(fā)病率高。由病毒引起的豬腹瀉病原比較常見的有豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PORV）3 種。有報道稱，其中PED 病例數(shù)占46%，遠(yuǎn)高于TGE（15%）和POR（8%），同時也存在三者混合感染的病例占31%。

豬流行性腹瀉病的治療無特效方案，控制該疫病以預(yù)防為主，同時加強飼養(yǎng)管理和生物安全措施。目前，市面上有PED-TGE 二聯(lián)苗有一定預(yù)防效果，但又因為病毒變異用疫苗預(yù)防效果差，有研究采用強毒返飼的方法也收到很好地凈化豬群PED效果。

4 結(jié)論

此次吉林省某豬場暴發(fā)的腹瀉，臨床上以水樣腹瀉為主，發(fā)病率達(dá)100%。剖檢病理變化以小腸和結(jié)腸黏膜充血、出血、腸管擴張膨脹、腸壁菲薄透明為特征的疫病，經(jīng)病理組織學(xué)觀察和病原分離鑒定，最終確診該疫病為豬流行性腹瀉。