劉靜，王曉林，田旭升，陳敏

（寧夏第四人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750021）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，是我國乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静?，因感染率高、發(fā)病率高，病程長且缺乏有效的疫苗嚴(yán)重影響人類的健康。近年來結(jié)核病發(fā)病和死亡人數(shù)均排法定甲乙類傳染病前列，且結(jié)核病是目前由單一致病菌導(dǎo)致死亡最多的疾病[1]，是我國重點(diǎn)控制的重大疾病之一。實(shí)驗(yàn)室檢查為診斷結(jié)核病提供重要依據(jù)，但是結(jié)核分枝桿菌抗酸染色陽性率低，特異性差，而結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)雖為結(jié)核分枝桿菌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)較長，難以滿足臨床實(shí)際需求[2-3]。利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（以下簡稱Xpert MTB/RIF）為半巢式熒光定量PCR方法，針對結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB基因上81bp利福平耐藥決定區(qū)進(jìn)行檢測，可得到是否存在結(jié)核分枝桿菌及該菌對利福平是否耐藥的結(jié)果。Xpert MTB/RIF檢測時(shí)間短，可在2.5 h內(nèi)獲得結(jié)果，能夠滿足臨床對快速診斷方法的迫切需求，對減少結(jié)核病傳播具有重要意義。本研究通過比較涂片染色、固體培養(yǎng)、固體藥敏和Xpert MTB/RIF檢測，分析Xpert MTB/RIF在結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測中的效能，為臨床選擇實(shí)驗(yàn)室檢測分析方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年5月我區(qū)疑似肺結(jié)核患者1271例，患者年齡13～93歲，其中男748例，女523例。對標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行抗酸染色涂片鏡檢、羅氏固體培養(yǎng)，比例法藥敏試驗(yàn)和Xpert MTB/RIF檢測。

1.2 儀器與試劑 Gene Xpert檢測儀器、Cartridge試劑盒及SR（sample reagent）均購自美國Cepheid公司，結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片所需金胺O染液為珠海BASO公司生產(chǎn)，LED顯微鏡為德國ZEISS品牌，固體培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為河南賽諾特公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]收集合格痰標(biāo)本3～5 ml，對標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行抗酸染色涂片鏡檢、羅氏固體培養(yǎng)，比例法藥敏試驗(yàn)和Xpert MTB/RIF檢測，比較幾種檢測方法的檢測效能。

1.3.2 抗酸染色涂片法 采用結(jié)核分枝桿菌金胺O熒光染色法染色，LED顯微鏡鏡檢。操作過程按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]進(jìn)行。

1.3.3 固體培養(yǎng) 痰培養(yǎng)采用改良羅氏固體培養(yǎng)法，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作。對培養(yǎng)出的菌株涂片染色進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 采用比例法固體藥敏試驗(yàn)，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.3.5 Xpert MTB/RIF 嚴(yán)格按照說明書步驟操作，前處理管中以1:2加入痰標(biāo)本和SR，吸取痰標(biāo)本時(shí)選取膿性及黏稠部分，漩渦震蕩10 s，室溫靜置15 min，待痰液充分液化后吸取2 ml至Cartridge試劑盒，上機(jī)檢測。所有初治患者經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測為利福平耐藥均做二次復(fù)檢確認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料n用%表示，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa檢驗(yàn)，Kappa≥0.75為兩種方法診斷結(jié)果一致性較好，0.4≤Kappa＜0.75,為兩種方法診斷結(jié)果一致性一般，Kappa＜0.4，為兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF檢測與抗酸桿菌涂片染色法檢測效能比較 樣本總計(jì)1271份，Xpert MTB/RIF檢測陽性582份，陽性率45.78%(582/1271)；抗酸桿菌涂片染色法檢測陽性442份，陽性率為34.77%(442/1271)。以抗酸桿菌涂片染色法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為94.34%(417/442)，特異度為80.10%(664/829)。將Xpert MTB/RIF與抗酸桿菌涂片染色法的結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05，Kappa=0.693，表明Xpert MTB/RIF與抗酸桿菌涂片染色法的一致性一般。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF檢測與抗酸桿菌涂片染色法檢測結(jié)果比較（n=1271）

2.2 Xpert MTB/RIF檢測與固體培養(yǎng)法檢測效能比較1271份樣本中經(jīng)改良羅氏固體培養(yǎng)法培養(yǎng)陽性492份，陽性率38.71%(492/1271)。以改良羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測靈敏度為94.31%(464/492)，特異度為84.85%(661/779)。將Xpert MTB/RIF與固體培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05，Kappa=0.766，表明Xpert MTB/RIF與固體培養(yǎng)法的一致性較好。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF檢測與固體培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較（n=1271）

2.3 Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥與比例法藥敏檢測效能比較464份培養(yǎng)陽性標(biāo)本完成耐藥檢測標(biāo)本385例。采用比例法藥敏試驗(yàn)檢測到耐藥菌株共77例，其中有58例利福平耐藥，利福平耐藥檢出率15.06%(58/385)。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥57例，利福平耐藥檢出率14.80%(57/385)。以傳統(tǒng)藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的靈敏度為98.28%(57/58),特異度為100%（327/327)。

兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.990，兩者具有較高一致性。見表3。

表3 Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥性結(jié)果（n=385）

3 討論

本研究中Xpert MTB/RIF、固體培養(yǎng)及抗酸染色涂片對結(jié)核分枝桿菌的檢測效能顯示，三種方法的陽性檢出率：Xpert MTB/RIF(45.78%)＞固體培養(yǎng)(38.71%)＞抗酸染色涂片(34.77%),與文獻(xiàn)報(bào)道相符[5-8]。研究顯示[9]，抗酸染色涂片法鏡檢陽性至少需要5×103CFU(菌落形成單位)/ml，而Xpert MTB/RIF的最低檢測限可達(dá)到131 CFU/ml，這大大提高了結(jié)核分枝桿菌的檢出率。并且對于涂片陰性的標(biāo)本，仍有約20.00%（165/829）經(jīng)過Xpert MTB/RIF檢測出陽性，Xpert MTB/RIF在涂陰肺結(jié)核的診斷方面顯示出明顯優(yōu)勢。對于培養(yǎng)，有118例培養(yǎng)陰性的標(biāo)本經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測出陽性，提示培養(yǎng)法可能受到不同性狀的標(biāo)本消化液的加入量，液化程度等因素的影響導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。這都顯示了Xpert MTB/RIF較高的檢測效能。

本研究結(jié)果顯示Xpert MTB/RIF檢測與固體培養(yǎng)及抗酸染色涂片具有較好的一致性，這與武曉英[10]、李靜[11]的研究結(jié)果一致。以改良羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測敏感度為94.31%（464/492），特異度為84.85%（661/779），與現(xiàn)有國內(nèi)外研究結(jié)果相似[12-13],說明Xpert MTB/RIF對結(jié)核分枝桿菌檢出率及準(zhǔn)確率高。

對利福平耐藥性的檢測結(jié)果顯示，比例法藥敏試驗(yàn)與Xpert MTB/RIF對利福平耐藥檢出率極其相近（15.06%，14.80%），檢測結(jié)果高度一致（Kappa=0.990）。且以傳統(tǒng)藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的靈敏度高達(dá)100%，特異度98.28%，與文獻(xiàn)結(jié)果相近[14]，說明Xpert MTB/RIF可以很好的檢測利福平的耐藥性。本研究傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)利福平耐藥檢出率15.06%，Xpert MTB/RIF方法利福平耐藥檢出率14.80%，與翁繩鳳等[15]研究結(jié)果一致，提示利福平耐藥情況不容樂觀，也從反方面體現(xiàn)出了Xpert MTB/RIF對利福平檢測的重要意義。從時(shí)間上講，相對于固體培養(yǎng)和傳統(tǒng)藥敏，Xpert MTB/RIF將利福平耐藥的肺結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)提前了4～8周，顯示了該技術(shù)在快速檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥的診斷價(jià)值。

在利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果中，有1例Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗(yàn)不符，比例法藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥，Xpert MTB/RIF檢測利福平敏感，Xpert MTB/RIF二次復(fù)核結(jié)果仍然為敏感。近年來的研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的利福平敏感菌株在81bp核心區(qū)都具有相同的核酸序列，利福平耐藥菌株中95%以上由rpoB基因突變導(dǎo)致。而此例不符合項(xiàng)推測原因很可能其突變區(qū)域不是rpoB基因，屬于95%rpoB基因突變之外的5%區(qū)域的突變。遺憾的是實(shí)驗(yàn)室不具備繼續(xù)進(jìn)行基因測序的實(shí)驗(yàn)條件，有待今后更多的研究討論。

本研究過程中嚴(yán)格把控痰標(biāo)本質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)涂片陽性率較本實(shí)驗(yàn)室之前的年涂片陽性率有約5%的提升，提示在日常工作中，需要進(jìn)一步加強(qiáng)標(biāo)本質(zhì)量控制。研究中發(fā)現(xiàn)，對于涂陽病人，Xpert MTB/RIF對利福平耐藥篩查非常有意義，可快速得到利福平是否耐藥的結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道，約90%利福平耐藥的結(jié)核患者同時(shí)會(huì)異煙肼耐藥[2]，對利福平單耐藥的患者，無論異煙肼是否耐藥，都會(huì)采取與耐多藥患者相同的治療方案。因此，檢測出利福平耐藥是多重耐藥結(jié)核的一個(gè)很好和可靠的替代指標(biāo)。這在臨床診療中將大大縮短診斷時(shí)間，對患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供幫助。而對于初治患者，實(shí)驗(yàn)室對于Xpert MTB/RIF利福平耐藥的檢測結(jié)果應(yīng)當(dāng)特別謹(jǐn)慎，需要進(jìn)行二次復(fù)檢確認(rèn)，防止誤診誤治。

綜上所述，Xpert MTB/RIF用于結(jié)核分支桿菌及其對利福平耐藥的檢測中具有較高靈敏度，特異性，準(zhǔn)確性高，檢測時(shí)間短，其快速高效的診斷對結(jié)核病患者尤其是耐多藥患者篩查具有重要意義，能夠?yàn)榕R床制定有效的診療措施提供可靠依據(jù)。