鄭媛媛，鄭素娟

（1.登封市人民醫(yī)院產(chǎn)科；2.登封市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南 登封 452470）

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊形式，無(wú)需外界干預(yù)，稽留流產(chǎn)中胚胎死亡而仍稽留于宮腔內(nèi)，且孕產(chǎn)物一般多在癥狀產(chǎn)生后1～2個(gè)月內(nèi)排出[1]?；袅鳟a(chǎn)約占自然流產(chǎn)的15%到20%，且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[2]。有關(guān)稽留流產(chǎn)的機(jī)制到目前為止并不明確，與母體染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、機(jī)體炎癥反應(yīng)和環(huán)境原因密切相關(guān)[3]。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是在凋亡過(guò)程中被上調(diào)的基因，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PDCD4是腫瘤抑制基因，在多種腫瘤細(xì)胞（肝細(xì)胞癌、侵襲性乳腺癌、人膠質(zhì)瘤、和鼻咽癌等）的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[4]。同時(shí)PDCD4還參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，microRNA-16（miR-16）靶向PDCD4可能通過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化中的有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-kB（NF-kB）信號(hào)傳導(dǎo)抑制炎性巨噬細(xì)胞的活化[5]。PDCD4缺乏會(huì)加速脂多糖/D-半乳糖胺（LPS/D-GalN）誘導(dǎo)的急性肝損傷，結(jié)腸炎以及與結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌，并明顯上調(diào)促炎性細(xì)胞因子（如IL-6）的表達(dá)，表明PDCD4作為抗炎因子的潛在作用[6-7]。目前，對(duì)稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織中PDCD4水平的檢測(cè)報(bào)道很少，而本研究擬通過(guò)測(cè)定稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織中PDCD4水平，并分析其與血清炎癥因子及激素水平的關(guān)系，這在國(guó)內(nèi)外比較少見(jiàn)，將為稽留流產(chǎn)發(fā)生機(jī)制的探討提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年2月至2019年12月本院婦產(chǎn)科稽留流產(chǎn)患者40例為病例組，同期終止妊娠的健康早孕婦女40例為對(duì)照組。研究對(duì)象自愿提供血清及絨毛與蛻膜組織用于待測(cè)。本研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意書(shū)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合稽留流產(chǎn)或早孕終止妊娠標(biāo)準(zhǔn)[8]；⑵年齡＞18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴采用輔助生殖技術(shù)受孕者；⑵近3個(gè)月有手術(shù)者；⑶合并心臟病或高血壓者；⑷早產(chǎn)胎膜破裂者；⑸前置胎盤或產(chǎn)前出血婦女。

1.2 方法

1.2.1 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA表達(dá)水平測(cè)定 使用TRIzol試劑（上海圣貢生物技術(shù)有限公司）從組織，血清中提取總RNA。經(jīng)過(guò)濃縮，純度和完整性檢測(cè)后，將1μg經(jīng)DNase I處理的RNA與用于RT-qPCR試劑盒的Hieff First Strand cDNA Synthesis Super Mix（Yeasen Biotech，Shanghai）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（Yeasen Biotech，上海）在ABI Prism 7300序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA）上進(jìn)行定量PCR分析。引物序列如下：PDCD4正向：5′-GCAAAGGGACGTCGGAGA-3′，反 向：5′-TCCAGGTTGTGCAGGTTGTT-3′，GAPDH蛋 白 正向：5′-CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT-3′，反向：5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′。根據(jù)檢測(cè)到的基因/樣品，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）蛋白用作內(nèi)源性對(duì)照。反應(yīng)條件如下：52℃3 min；94℃12 min，93℃30 s，60℃1 min（40個(gè)循環(huán)）。反應(yīng)體系為：正向引物10μl、反向引物10μl、RNA模版0.6μl、超級(jí)酶混合物0.2μl、2×μByr。通過(guò)使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白表達(dá)水平測(cè)定 用裂解緩沖液提取血清、絨毛蛻膜組織中蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（均來(lái)自中國(guó)江蘇海門的Beyotime生物技術(shù)研究所）來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。采用免疫印跡分析（Western blot法）將蛋白裂解物在12%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（Millipore，Billerica，MA，USA），再用5%的脫脂奶粉封閉該膜。接下來(lái)，將膜與兔抗PDCD4單 克 隆 抗 體（ab6721；Abcam，Cambridge，MA，USA）以及GAPDH（ProteinTech，Chicago，IL，USA）孵育過(guò)夜，再用Tween的Tris緩沖鹽水（TBST）洗滌四次，并與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗培養(yǎng)2 h。采取增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（Pierce，Rockford，IL，美國(guó)）來(lái)顯示蛋白條帶。

1.2.3 血清中TNF-α、雌二醇、孕酮水平測(cè)定TNF-α、雌二醇、孕酮采用ELISA法測(cè)定，試劑盒購(gòu)于武漢華美生物科技有限公司 （批號(hào)：ZW54896.63、XW1258.63、BGA52478.63）。 按 照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)比較；采用Pearson相關(guān)性分析探討變量之間相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 兩組年齡、BMI、妊娠周數(shù)、TG、HDL-C、LDL-C等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 兩組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平比較 病例組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA水平低于對(duì)照組，病例組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白水平低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 兩組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平表達(dá)

圖1 各組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白電泳圖

2.3 兩組血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比較 表3所見(jiàn)，病例組血清TNF-α水平高于對(duì)照組，雌二醇、孕酮水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比較

2.4 各變量相關(guān)分析 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平與血清TNF-α負(fù)相關(guān)，與血清雌二醇、孕酮正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各變量的相關(guān)分析

3 討論

PDCD4最初是一個(gè)與凋亡相關(guān)的基因，后來(lái)被鑒定為抑癌基因。同時(shí)，它還參與了一些急性和慢性炎癥性疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化、飲食引起的肥胖、LPS/D-GalN引起的急性肝損傷、結(jié)腸炎等[9]。絨毛被稱為母體子宮組織，它在保護(hù)胚胎免受母體免疫細(xì)胞攻擊中起著至關(guān)重要的作用，并為胎盤形成之前的胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)支持。有研究報(bào)道，類維生素A-干擾素引起的絨毛組織發(fā)育不良與新生血管抑制導(dǎo)致的流產(chǎn)有關(guān)，在流產(chǎn)的絨毛樣樣品中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)下調(diào)，提示VEGF可能在稽留流產(chǎn)中起重要作用[10-11]。PDCD4與VEGF具有類似的促進(jìn)血管生成功能[12]。本研究中qRT-PCR和Western blot的結(jié)果顯示，病例組血清，絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平低于對(duì)照組，這說(shuō)明，低水平的PDCD4可能導(dǎo)致了絨毛蛻膜組織血管發(fā)育不良進(jìn)而誘導(dǎo)稽留流產(chǎn)。

本研究檢測(cè)了TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示流產(chǎn)患者TNF-α水平較高，進(jìn)一步采用Pearson相關(guān)分析血清、絨毛蛻膜組織PDCD4與TNF-α水平的相關(guān)性，提示PDCD4的表達(dá)與TNF-α之間正相關(guān)；這也說(shuō)明PDCD4在稽留流產(chǎn)炎癥反應(yīng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞因子在維持胎兒和母體免疫系統(tǒng)之間的體內(nèi)平衡方面起著重要作用，如果打破這種微妙的平衡，則免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能不足以恢復(fù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并可能導(dǎo)致妊娠失敗[13-14]。既往研究表明PDCD4通過(guò)影響細(xì)胞因子（如TNFα、IL-12）的分泌而參與炎癥相關(guān)性疾病[15]。

本研究檢測(cè)了母體中血清雌二醇和孕酮的水平，結(jié)果表明，病例組血清雌二醇、孕酮水平低于對(duì)照組，這些結(jié)果表明正常雌二醇和孕酮與健康懷孕的發(fā)展和保護(hù)有關(guān)。分析認(rèn)為，成功懷孕期間，蛻膜化是一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程（子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞），這種轉(zhuǎn)化受雌激素和孕激素等激素控制，并協(xié)調(diào)胚胎著床和胎盤的形成。這對(duì)于實(shí)現(xiàn)母體對(duì)同種異體胎兒的免疫耐受也起著決定性作用[16]。此外，采用Pearson相關(guān)性分析在稽留流產(chǎn)患者中，雌二醇水平低與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞水平下降和炎癥因子IL-4產(chǎn)生呈正相關(guān)，這也再一次提示炎癥反應(yīng)在稽留流產(chǎn)中的重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA蛋白水平與血清雌二醇、孕酮正相關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)黃體酮可以下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)[17-18]。本研究中，與對(duì)照組相比，稽留流產(chǎn)患者血清中孕酮水平低，稽留流產(chǎn)蛻膜組織中PDCD4表達(dá)降低，這提示稽留流產(chǎn)患者中PDCD4的下調(diào)與低水平孕酮相關(guān)，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織PDCD4表達(dá)水平降低；PDCD4與稽留流產(chǎn)患者炎癥反應(yīng)及激素水平紊亂有相關(guān)性，這可能是稽留流產(chǎn)的機(jī)制之一。