賈立云，封紀(jì)珍，王 熙，馬翠霞，封露露

(河北省石家莊市婦幼保健院新生兒疾病篩查診治中心，河北 石家莊 050051)

原發(fā)性肉堿缺乏癥(primary carnitine deficiency,PCD)又稱肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙或肉堿攝取障礙，是由于細(xì)胞膜肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因SLC22A5突變致脂肪酸β氧化障礙而引發(fā)的疾病，是脂肪酸氧化代謝障礙中最常見的疾病類型，遺傳方式為常染色體隱性遺傳[1]。肉堿缺乏可導(dǎo)致中、長(zhǎng)鏈脂肪酸不能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化，進(jìn)而引起一系列生化代謝異常，最終導(dǎo)致肝臟、心肌、骨骼肌等多系統(tǒng)損害[2]。PCD可于任何年齡發(fā)病，是潛在的致死性疾病。臨床表現(xiàn)個(gè)體差異較大，主要表現(xiàn)為低酮型低血糖、肌無力、肝腫大以及擴(kuò)張型心肌病，部分患者可終生無異常表現(xiàn)，發(fā)病的患者未經(jīng)治療具潛在致死性[3]，左旋肉堿替代治療的介入，使越來越多PCD患者的預(yù)后得到了改善。同時(shí)，PCD發(fā)病機(jī)制和基因突變的研究也在不斷地深入。PCD患兒臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性及非特異性特點(diǎn)，易誤診或漏診，隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，新生兒檢出率顯著提高[4-5]。本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新生兒進(jìn)行多種遺傳代謝病篩查，統(tǒng)計(jì)出石家莊地區(qū)PCD患病率為1/17 785，進(jìn)一步采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)部分患兒進(jìn)行SLC22A5基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了4種突變位點(diǎn)。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 收集2014年1月—2019年12月在石家莊市15個(gè)縣區(qū)所轄的26個(gè)助產(chǎn)機(jī)構(gòu)、7個(gè)市區(qū)所轄的12個(gè)助產(chǎn)機(jī)構(gòu)分娩的160 061例活產(chǎn)新生兒(3～20 d)。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(No.202019)，篩查前家長(zhǎng)均簽署知情同意書。

1.2串聯(lián)質(zhì)譜篩查及基因突變檢測(cè)

1.2.1儀器與試劑 Waters TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777C自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 1 525 μ高效液相色譜儀泵及MassLynxV4.1串聯(lián)質(zhì)譜篩查信息處理系統(tǒng)均購自美國(guó)Waters公司；微孔板恒溫孵育震蕩儀購自中國(guó)杭州奧盛儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)購自中國(guó)康士潔有限公司；通風(fēng)柜購自中國(guó)杰瑞電氣有限公司；串聯(lián)質(zhì)譜-非衍生化游離肉堿及?；鈮A測(cè)定試劑盒購自中國(guó)山東英盛公司。

1.2.2標(biāo)本采集 新生兒出生72 h，充分哺乳6～8次后，于足跟兩側(cè)采集3個(gè)直徑>8 mm、圓形均勻血斑，懸空自然晾干2～3 h，置于密封袋封口，最遲不超過5個(gè)工作日由各助產(chǎn)單位上報(bào)至婦幼機(jī)構(gòu)并冷鏈遞送至石家莊市新生兒疾病篩查中心，置于2～8 ℃冰箱密封保存待檢。

1.2.3檢測(cè)方法 采用串聯(lián)質(zhì)譜干血濾紙片—非衍生法：用打孔器取直徑3 mm高、低質(zhì)控樣本和待測(cè)樣本血斑，置于U型底96孔微孔板中；每孔加入90 μL萃取工作液，30 ℃，700 r/min，震蕩孵育45 min；轉(zhuǎn)移75 μL上清液至V型底96孔板的對(duì)應(yīng)位置，覆上鋁箔紙以減少揮發(fā)；將V型板放入自動(dòng)進(jìn)樣器中，建立樣品列表，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，采用MassLynxV4.1串聯(lián)質(zhì)譜篩查信息處理系統(tǒng)，通過比較分析物和內(nèi)標(biāo)分析物的信號(hào)積分面積來進(jìn)行計(jì)算待檢物濃度水平。

1.2.4質(zhì)量控制 檢測(cè)過程中將質(zhì)控及樣品共同測(cè)定，質(zhì)控品的處理方法及上機(jī)檢測(cè)條件與樣本一致，高、低質(zhì)控品的檢測(cè)值在靶值±2SD范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)過程的質(zhì)量控制，以及每年參加國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)并取得合格證書。

1.2.5診斷方法 ①血游離肉堿水平持續(xù)低于7 μmol/L，需鑒別是否為母源性肉堿缺乏；②肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因SLC22A5檢測(cè)到突變。

1.3治療與隨訪 對(duì)確診病例采用左卡尼汀替代治療，具體劑量依據(jù)肉堿水平進(jìn)行調(diào)整。急性期靜脈給藥，劑量為200～400 mg·kg-1·d-1，并同時(shí)對(duì)癥支持治療；穩(wěn)定期口服給藥，劑量為100～200 mg·kg-1·d-1，分3次給藥。此外，避免饑餓及長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，防止低血糖發(fā)生。治療初期隔2～3周隨訪1次，血游離肉堿正常且穩(wěn)定后隔1～3個(gè)月隨訪1次，治療期間定期進(jìn)行相關(guān)檢查，及時(shí)調(diào)整治療方案，并評(píng)估生長(zhǎng)、智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育情況。

2 結(jié) 果

2.1PCD患兒總體篩查情況 160 061例新生兒中，篩查陽性患兒21例，召回20例，確診17例，其中PCD 9例，患病率為1/17 785；母源性肉堿缺乏患兒8例。

2.29例PCD患兒及母親串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果 9例PCD患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初篩結(jié)果中游離肉堿及多種酰基肉堿水平降低，游離肉堿為4.47(1.77～6.78) μmol/L；復(fù)查結(jié)果為4.83(2.80～7.32) μmol/L；患兒母親肉堿水平檢測(cè)結(jié)果顯示游離肉堿及酰基肉堿水平基本居于正常水平，游離肉堿水平為12.97(11.16～15.36) μmol/L，排除母源性，見表1。

表1 9例PCD患兒及母親游離肉堿及酰基肉堿檢測(cè)水平Table 1 Detection levels of free carnitine and acylcarnitine in 9 neonates with PCD and their mothers [n=9，M(最低值～最高值)，μmol/L]

2.38例母源性肉堿缺乏癥患兒及母親串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果 8例母源性肉堿缺乏癥患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，初篩結(jié)果游離肉堿及多種?；鈮A水平降低，其中游離肉堿初篩結(jié)果為4.52(2.70～7.93) μmol/L；復(fù)查結(jié)果為6.09(4.14～10.04)μmol/L，較初篩水平有所升高；患兒母親游離肉堿及?；鈮A水平均低于正常水平，游離肉堿水平為3.46(1.50～7.86) μmol/L，見表2。

表2 8例母源性肉堿缺乏癥患兒及母親游離肉堿及?；鈮A檢測(cè)水平Table 2 Detection levels of free carnitine and acylcarnitine in 8 cases of neonates with maternal carnitine deficiency and their mothers [n=8，M(最低值～最高值)，μmol/L]

2.44例PCD患兒基因突變分析 9例PCD患兒中，4例進(jìn)行了SLC22A5基因檢測(cè)，其中復(fù)合雜合1例、純合1例、雜合2例，見表3。2例雜合患兒血游離肉堿和酰基肉堿水平持續(xù)下降，排除母源性。基因突變分析發(fā)現(xiàn)4種突變位點(diǎn)，分別為c.865C>T、c.1400C>G、c.428C>T和c.1462C>T，見圖1。

表3 4例PCD患兒基因突變分析結(jié)果Table 3 Results of gene mutation analysis in 4 neonates with PCD

2.5治療與隨訪結(jié)果 9例PCD患兒中6例持續(xù)接受治療，左卡尼汀劑量為100～200 mg·kg-1·d-1，發(fā)育正常；3例患兒治療一段時(shí)間后停藥，發(fā)育正常。患兒治療后肉堿水平見表4；治療及發(fā)育情況見表5。

表4 9例PCD患兒治療后游離肉堿及?；鈮A水平Table 4 Levels of free carnitine and acylcarnitine in 9 neonates with PCD after treatment [n=9,M(最低值～最高值),μmol/L]

3 討 論

3.1PCD篩查與診斷 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，使得越來越多的PCD患兒可以在新生兒早期被發(fā)現(xiàn)，PCD的診斷主要依賴于血游離肉堿及?；鈮A的水平以及SLC22A5基因突變分析。本研究檢出的9例PCD患兒初篩血游離肉堿均低于實(shí)驗(yàn)室截?cái)嘀?<7 μmol/L)，均值只有4.47 μmol/L；9例PCD患兒母親血游離肉堿均值為12.97 μmol/L，而8例母源性肉堿缺乏癥患兒母親血游離肉堿均值僅為3.46 μmol/L。因此，對(duì)患兒及其母親進(jìn)行血游離肉堿水平檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)母親PCD。隨著二代測(cè)序技術(shù)的不斷推廣應(yīng)用，基因檢測(cè)可明確PCD患兒病因；本研究檢出的9例PCD患兒中，只有4例患兒進(jìn)行了基因檢測(cè)。

3.2PCD患病率 PCD患病率具有明顯種族差異，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該病在法羅群島患病率最高，為1/300[6]，美國(guó)患病率為1/20 000～1/70 000[7]，日本患病率為1/40 000[8]，澳大利亞的患病率為1/120 000[9]，中國(guó)報(bào)道的新生兒篩查PCD患病率為1/20 000～45 000[10-11]，人群中雜合子的攜帶率為0.5%～0.1%[12-13]。本研究共篩查新生兒160 061例，確診PCD 9例，患病率為1/17 785，高于我國(guó)報(bào)道的新生兒篩查PCD患病率，考慮可能與地域差異和統(tǒng)計(jì)年限有關(guān)。

3.3基因突變分析 PCD的致病基因?yàn)镾LC22A5，該基因定位于染色體5q31.1，長(zhǎng)約30 kb，包含10個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，其編碼的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由557個(gè)氨基酸組成[14]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)180余種突變類型，多為錯(cuò)義突變，無義突變和移碼突變次之[2]；國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究認(rèn)為c.760C>T(p.R254X)和c.1400C>G(p.S467C)是我國(guó)大陸地區(qū)的熱點(diǎn)突變[15]。本研究4例患兒中復(fù)合雜合1例、純合1例、雜合2例，其中c.1400C>G(p.S467C)的突變頻率較高，為33.3%，與溫鵬強(qiáng)等[14]報(bào)道的結(jié)果相符，未發(fā)現(xiàn)c.760C>T(p.R254X)，考慮可能與病例少有關(guān)。

3.4治療及隨訪 PCD可于任何年齡發(fā)病，主要表現(xiàn)為擴(kuò)張性心肌病、肝腫大、肌無力等，若未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，可導(dǎo)致死亡，因此，早期篩查、診斷及治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。PCD的治療原則是避免感染、長(zhǎng)期饑餓及高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，需用左卡尼汀進(jìn)行替代治療，維持血漿游離肉堿水平>15～20 μmol/L。出現(xiàn)能量代謝危象時(shí)，立即靜脈輸注葡萄糖，以維持血糖>5 mmol/L，并靜脈或口服左卡尼汀200～400 mg·kg-1·d-1；病情緩解期需根據(jù)血游離肉堿水平進(jìn)行個(gè)體化治療，建議口服左卡尼汀100～300 mg·kg-1·d-1；穩(wěn)定期可根據(jù)血游離肉堿水平，口服左卡尼汀100～200 mg·kg-1·d-1[3]。本研究檢出的9例PCD患兒確診后立即給予左卡尼汀替代治療，其中3例患兒治療一段時(shí)間后停藥，其余6例患兒均持續(xù)接受藥物治療，隨訪結(jié)果未出現(xiàn)臨床癥狀，發(fā)育正常。

采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒疾病篩查，可及早檢出患兒及母親PCD，并給予早期干預(yù)和治療，使患兒生長(zhǎng)、智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常；二代測(cè)序技術(shù)可進(jìn)行相關(guān)基因突變檢測(cè)；二者聯(lián)合應(yīng)用可明確病因，對(duì)家系提供遺傳病咨詢依據(jù)。