馮明星, 胡兆農(nóng)*,,,3, 吳文君

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省植物源農(nóng)藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

21 世紀(jì)以來(lái)，開(kāi)發(fā)具有高效、低毒、安全系數(shù)高、選擇性和環(huán)境相容性好的新農(nóng)藥已成為農(nóng)藥研發(fā)的主要目標(biāo)，而利用靶標(biāo)酶設(shè)計(jì)綠色環(huán)保農(nóng)藥已成為農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域[1]。迄今，研究發(fā)現(xiàn)作用于昆蟲(chóng)中腸的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)有蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis (Bt) 毒素蛋白和殺蟲(chóng)植物苦皮藤 Celastrus angulatus 中的苦皮藤素。Bt 作用昆蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞膜上的靶標(biāo)主要有氨肽酶[2]、堿性磷酸酶[3]、肌動(dòng)蛋白[4]及一些糖脂[5]，其中氨肽酶和堿性磷酸酶普遍被認(rèn)為是Bt 毒素蛋白結(jié)合的初始靶標(biāo)，這為后期毒素蛋白插入昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜形成“孔洞”奠定了基礎(chǔ)[6]；而苦皮藤素在昆蟲(chóng)體內(nèi)的作用靶標(biāo)為V-ATP 酶H 亞基[7-9]。

殺蟲(chóng)植物杠柳Periploca sepium Bunge 為蘿藦科 (Asclepiadaceae) 杠柳屬蔓生性灌木，其根皮中含有一類(lèi)殺蟲(chóng)活性成分——杠柳新苷類(lèi)化合物[10]。前期研究表明，這類(lèi)化合物主要作用于東方黏蟲(chóng)Mythimna separata Walker 幼蟲(chóng)的中腸腸壁細(xì)胞[11-14]，推測(cè)杠柳新苷類(lèi)化合物有可能在昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜上具有類(lèi)似Bt 毒素蛋白或苦皮藤素的作用靶標(biāo)[15-16]。此外，根據(jù)杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)東方黏蟲(chóng)的作用癥狀，結(jié)合定量差異蛋白組學(xué)鑒定的表達(dá)差異蛋白功能特性分析，認(rèn)為V-ATP 酶、氨肽酶、堿性磷酸酶均有可能是杠柳新苷類(lèi)化合物的疑似作用靶標(biāo)[17]。本研究在比較6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)3 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)胃毒毒力基礎(chǔ)上，測(cè)定了它們對(duì)東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸特征酶V-ATP 酶、氨肽酶和堿性磷酸酶的酶比活力的影響，旨在為進(jìn)一步研究杠柳新苷類(lèi)化合物可能的作用靶標(biāo)及其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 昆蟲(chóng) 東方黏蟲(chóng)Mythimna separata Walker幼蟲(chóng)由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所養(yǎng)蟲(chóng)室提供，為小麥或玉米葉片人工累代飼養(yǎng)30 代以上的敏感品系，飼養(yǎng)溫度為 (22 ± 1) ℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光周期為L(zhǎng) : D = 16 h : 8 h。

1.1.2 化合物 杠柳新苷A (PSA)、杠柳新苷D(PSD)、杠柳新苷E (PSE)、杠柳新苷F (PSF)、杠柳新苷P (PSP) 和杠柳新苷T (PST)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所從杠柳根皮提取物中分離得到，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖式1 所示。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)其純度達(dá)98%以上。

1.1.3 供試試劑 Bradford 法蛋白定量測(cè)定試劑盒 (PA102) 購(gòu)于北京天根公司；腺苷三磷酸-三羥甲基氨基甲烷 (Tris-ATP)、原釩酸鈉、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 (HEPES)、碳酸氫鈉、2-嗎啉乙磺酸 (Mes) 和巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1,CAS88899-55-2) (純度 ≥ 95%) 購(gòu)于Sigma 公司；乙二醇雙 (2-氨基乙基醚) 四乙酸 (EGTA)，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；MgSO4等無(wú)機(jī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于廣東光華公司；乙醚為分析純，購(gòu)于西隴化工；Protease Inhibitor Cocktail (EDTAfree) 購(gòu)于Roche 公司；Bestatin 購(gòu)自美國(guó)Apexbio 公司；L-亮氨酸-p-硝基苯胺 (Leu-pNA) 購(gòu)自上?？茀R公司。

1.1.4 主要儀器 Sorvall ST16R 冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific 公司；CR22G III 高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi 公司；BG25 金屬浴，杭州博日科技有限公司；Infinite M 200 Pro 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司；Seven Easy S20 pH 計(jì)，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.1.5 緩沖液的配制

1.1.5.1 東方黏蟲(chóng)中腸細(xì)胞中BBMV 提取純化所用緩沖溶液 Buffer A：300 mmol/L 甘露醇，5 mmol/L EGTA，17 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (現(xiàn)用現(xiàn)配)。

Buffer B：150 mmol/L Mannitol，2.5 mmol/L EGTA，8.5 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L PMSF (現(xiàn)用現(xiàn)配)。

Buffer C：150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)，1% 3-[(3-膽固醇氨丙基) 二甲基氨基]-1-丙磺酸 (CHAPS)；1 mmol/L PMSF (現(xiàn)用現(xiàn)配)。

Buffer D：24 mmol/L MgCl2。

1.1.5.2 V-ATP 酶活性測(cè)定所用緩沖液 Ringer Solution：25 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，3.5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L NaHCO3，1.0 mmol/L MgSO4，1.7 mmol/L CaCl2，5 mmol/L葡萄糖，pH = 7.1。

Lysis Buffer-PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L 2-巰基乙醇 (Mercapto EtOH), pH ＝ 7.1。

Lysis Buffer + PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L Mercapto EtOH，PIC(Protease Inhibitor Cocktail)，pH ＝ 7.1。

PO Buffer：160 mmol/L Tris-Mes，pH = 6.9。

MV Buffer：30 mmol/L MgCl2，0.8 mmol/L原釩酸鈉，98 ℃煮沸3 min。

KN Buffer：160 mmol/L KCl，4 mmol/L NaN3(10 × KN：2.6 mg/mL)。

8 mmol/L Tris-ATP：用ddH2O 配制為8 mmol/L，分裝后保存于 -20 ℃。

巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1)：用DMSO稀釋至48 μmol/L (陽(yáng)性對(duì)照藥劑)。

鉬酸鈉溶液：將3 份200 mmol/L 的鉬酸鈉溶液加入到6 份ddH2O 中，然后加入1 份現(xiàn)配的24%硫酸。

孔雀石綠 (Malachite Green)：18.5 mg 孔雀石綠溶于25 mL 1%聚乙烯醇中。

1.1.5.3 氨肽酶活性測(cè)定所用緩沖液 反應(yīng)緩沖液：0.25 mol/L Tris-HCl (pH = 7.8)，26 mol/L NaCl；反應(yīng)底物：15.96 mg Leu-pNA 溶于1 mL 甲醇 (現(xiàn)配現(xiàn)用)；Bestatin：10 μmol/L Bestatin 溶液 (陽(yáng)性對(duì)照藥劑)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 杠柳新苷類(lèi)化合物的殺蟲(chóng)活性 采用載毒葉片飼喂法[18]測(cè)定6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物 (PSA、PSD、PSE、PSF、PSP 和PST) 對(duì)東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的胃毒毒力：挑選蛻皮第2 天的3 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)，置于培養(yǎng)皿內(nèi)饑餓12 h 備用。將待測(cè)化合物用丙酮分別配制為供試?yán)ハx(chóng)死亡率在10%～90%范圍的系列濃度梯度的溶液。用1 μL微量點(diǎn)滴器將不同濃度的藥液分別涂布于0.5 cm × 0.5 cm 小麥或玉米葉片上，以用等量丙酮涂布的處理作為空白對(duì)照。待溶劑揮發(fā)后，將其置于24 孔板中，每孔放置1 片載毒葉片及1 頭饑餓處理的3 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)。每處理設(shè)置20 頭試蟲(chóng)，重復(fù)3 次。用濕紗布保濕，在22～25 ℃、相對(duì)濕度為70%～80% 的養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)飼養(yǎng)。不定時(shí)觀察幼蟲(chóng)中毒癥狀。采用SPSS20.0 軟件 (SPSS Inc., Chicago, USA)統(tǒng)計(jì)分析試蟲(chóng)24 h 死亡結(jié)果，并計(jì)算LC50值。

1.2.2 東方黏蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 的制備和檢測(cè) 東方黏蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 的制備參照MgCl2沉淀差速離心法[19]。挑選蛻皮第2 天的5 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)，經(jīng)12 h 饑餓后解剖其中腸。首先，用預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的氯化鈉溶液將解剖得到的中腸清洗干凈，經(jīng)濾紙吸干水分后稱(chēng)量。將4.5 mL Buffer A 溶液加入500 mg 解剖中腸中，用玻璃勻漿器于冰上進(jìn)行手動(dòng)勻漿5 次，每次1 min，兩次間隔1 min。隨后，加入等體積 (4.5 mL) 24 mmol/L的氯化鎂溶液，冰浴15 min 后，于4 ℃、2 500 g下離心15 min，留取上清液 (記為第1 次離心所得) 置于冰上；用4.5 倍體積 (2.25 mL) 的Buffer A 溶液及等體積24 mmol/L 的氯化鎂溶液將離心所得沉淀重懸；再次于4 ℃、2 500 g 下離心15 min，取上清液 (記為第2 次離心所得) 置于冰上；用4.5 倍體積 (2.25 mL) 的Buffer A 及等體積24 mmol/L 的氯化鎂將第2 次離心所得沉淀再次重懸，冰浴15 min，然后于4 ℃、2 500 g 下再次離心15 min，取上清液 (記為第3 次離心所得) 置于冰上。將3 次離心所得的上清液合并，于4 ℃、30 000 g 下離心30 min；將沉淀重懸于Buffer B 溶液，冰浴4 h，再次于4 ℃、30 000 g 下離心30 min。棄去上清液，沉淀懸于Buffer C 溶液，用于氨肽酶及堿性磷酸酶活測(cè)定。

東方黏蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 的制備質(zhì)量檢測(cè)方法：將提取的BBMV 和中腸粗酶液作為反應(yīng)物，分別測(cè)定其中堿性磷酸酶和氨肽酶的活性，比較獲得BBMV 的濃縮倍數(shù)，從而判斷其純度。

1.2.3 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，參照Bradford 的方法[20]測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將1 mg/mL 的BSA 母液依次稀釋為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL；依次取10 μL 加入到96 孔板內(nèi)，再加入190 μL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，混勻后室溫放置5～10 min，使用酶標(biāo)儀在595 nm 處讀數(shù)。

樣品測(cè)定：將待測(cè)樣品稀釋至合適濃度，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法。

1.2.4 杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)氨肽酶的活性測(cè)定 將供試6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。氨肽酶的活性參考Hafkenscheid 等的方法[21]以Leu-pNA 為底物進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取Leu-pNA 15.96 mg 溶于1 mL 甲醇中(現(xiàn)用現(xiàn)配)。在1.5 mL 無(wú)菌無(wú)酶離心管中加入底物反應(yīng)緩沖液1 mL，分別將待測(cè)蛋白樣品10 μL，或其與杠柳新苷類(lèi)化合物、陽(yáng)性對(duì)照藥劑Bestatin 1.6 μL，于37 ℃水浴鍋中孵育30 min；再加入底物L(fēng)eu-pNA 16 μL，于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min。最后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于405 nm 下測(cè)定其相應(yīng)吸光度。

1.2.5 杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)堿性磷酸酶的活性測(cè)定 將供試6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。堿性磷酸酶活性參照Lowry 等的方法[22]測(cè)定。在96 孔板中分別加入0.5 mL 酶液、2 mL 0.04 mol/L 的巴比妥鈉鹽酸緩沖液、或者1.75 mL 0.04 mol/L 的巴比妥鈉鹽酸緩沖液、0.25 mL 杠柳新苷類(lèi)化合物或陽(yáng)性對(duì)照藥劑Na2VO4、0.5 mL 7.5 mmol/L 對(duì)硝基苯磷酸二鈉，于37 ℃溫浴30 min。取出后加入2 mL 0.1 mol/L 的氫氧化鈉終止反應(yīng)。常溫下平衡15 min，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于405 nm 測(cè)定其相應(yīng)吸光度值。

1.2.6 杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)V-ATP 酶的活性測(cè)定 參照Tiburcy 等的方法測(cè)定[23]。挑取6 齡初未饑餓東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)，解剖取中腸，棄去內(nèi)容物及圍食膜。在解剖鏡下于預(yù)冷的Ringer Solution中去除馬氏管及食物殘?jiān)?，取中腸后部置于預(yù)冷的低吸附EP 管中。于液氮中迅速冷凍后，加入20 μL Lysis buffer-PIC，于冰上用微量勻漿棒充分勻漿，補(bǔ)足體積至200 μL。于20 000 r/min、4 ℃下離心20 min；棄去上清液，加入200 μL Lysis Buffer-PIC，重懸沉淀，于20 000 r/min、4 ℃下，離心20 min。棄去上清液后，將沉淀溶解于200 μL Lysis Buffer + PIC，采用Broadford 法測(cè)蛋白濃度后，用于后續(xù)酶活測(cè)定。

于1.5 mL EP 管中分別加入50 μL Buffer PO、20 μL MV 和20 μL KN，隨后加入40 μL 上述步驟獲得的酶液、10 μL DMSO 或供試化合物或Bafilomycin A1 (陽(yáng)性對(duì)照)，每處理3 次重復(fù)。于30 ℃孵育10 min 后，依次向每個(gè)離心管中加入20 μL 底物Tris-ATP (8 mmol/L)，于30 ℃孵育1 h。終止反應(yīng)時(shí)，依次按照加入底物的順序?qū)㈦x心管置于液氮中，于 -20 ℃保存用于無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定。

無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定參考Wieczorek 等方法[24]。于1.5 mL 離心管內(nèi)吸取100 μL 鉬酸鹽 (molybdate)溶液，向酶促反應(yīng)后的樣品管1 內(nèi)加入50 μL 20%三氯乙酸 (TCA) 溶液，于70 ℃反應(yīng)15 s；隨后分別于30 s、1.5 min 和2 min 時(shí)依次向樣品管2、3、4 中加入50 μL TCA 溶液，于70 ℃反應(yīng)15 s。2 min 時(shí)，將樣品管1～4 離心1 min。分別于3.5、4、4.5 和5 min 時(shí)，依次取樣品管1～4 中的上清液60 μL，加入到100 μL molybdate 中溶解并混勻；反應(yīng)15 s 后，依次向上述混合液中加入30 μL 孔雀石綠，混勻；反應(yīng)2 min 后，再依次向上述混合液中加入200 μL H2SO4并混勻；室溫孵育70 min 后于625 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

參考Cheng 等方法[25]通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到無(wú)機(jī)磷的含量：將105 ℃烘干至恒重的KH2PO4用雙蒸水 (ddH2O) 配制成1 mmol/L 的母液，再用ddH2O 將母液稀釋50 倍，制成0.02 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 個(gè)不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于10 個(gè)試管內(nèi) (濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L)，加入ddH2O 使每個(gè)試管內(nèi)的體積均為1 mL。每管內(nèi)加入0.5 mL 20% TCA 和0.4 mL 酸性鉬酸鈉，搖勻后15 s，再加入0.3 mL孔雀綠試劑，反應(yīng)2 min 后加入2 mL 7.8%硫酸，室溫放置70 min 后，于625 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，磷的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析均采用SPSS20.0軟件 (SPSS Inc., Chicago, USA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。光度計(jì)測(cè)定數(shù)據(jù)均采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean ± SD)表示。組間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，P ＜ 0.05 為差異顯著。每個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)及處理均至少進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杠柳新苷類(lèi)化合物的殺蟲(chóng)活性

測(cè)定結(jié)果如表1 所示：在6 個(gè)化合物中，PSP和PST 對(duì)3 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，其LC50值分別為1.60 和1.23 mg/mL；PSA、PSD 和PSF 均表現(xiàn)出微弱的殺蟲(chóng)活性，其LC50值分別為28.68、22.44 和21.31 mg/mL；PSE 則無(wú)明顯殺蟲(chóng)活性。

2.2 杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)BBMV 中氨肽酶和堿性磷酸酶活性的影響

結(jié)果表明，6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物在20、40、80、200 μmol/L 濃度下，對(duì)氨肽酶和堿性磷酸酶的活性均沒(méi)有明顯抑制作用，與溶劑對(duì)照DMSO組的結(jié)果相同。而陽(yáng)性對(duì)照氨肽酶特異性抑制劑Bestatin 在10 μmol/L 下對(duì)氨肽酶的抑制率可達(dá)到50%以上，堿性磷酸酶特異性抑制劑Na2VO4在100 μmol/L 下對(duì)堿性磷酸酶的抑制率可達(dá)到70%以上。

2.3 杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)V-ATP 酶活性的影響

杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 中V-ATP 酶活性的影響如圖1 所示。陽(yáng)性對(duì)照Bafilomycin A1 為V-ATP 酶一種特異的抑制劑，在所有單獨(dú)試驗(yàn)組中均表現(xiàn)出顯著抑制，在3 μmol/L 濃度下抑制率達(dá)到45%左右；而6 個(gè)化合物中，僅有PSP 和PST 對(duì)V-ATP 酶表現(xiàn)出顯著抑制，PSA、PSD、PSE 和PSF 對(duì)其均無(wú)顯著的抑制作用。

為驗(yàn)證杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)V-ATP 酶活性影響的準(zhǔn)確性，每組試驗(yàn)中均設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和杠柳新苷的聯(lián)合處理。如果杠柳新苷的作用對(duì)象不是V-ATP 酶而是其他酶類(lèi)，那么聯(lián)合用藥處理后其抑制效果將呈現(xiàn)加成作用，其抑制率將明顯高于二者單獨(dú)作用時(shí)的處理效果。從圖1 可以看出，在聯(lián)合用藥下，對(duì)V-ATP 酶活性的影響均與陽(yáng)性對(duì)照Bafilomycin A1 無(wú)顯著性差異，這也進(jìn)一步說(shuō)明杠柳新苷類(lèi)化合物PSP 和PST 確實(shí)抑制了V-ATP 酶的活性。另外，從圖1E 和1F 中可以看出，杠柳新苷對(duì)V-ATP 酶的活性表現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性。因此，推測(cè)V-ATP 酶為杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物的作用靶酶。

3 討論與結(jié)論

生物測(cè)定結(jié)果表明，在6 個(gè)供試杠柳新苷類(lèi)化合物中，PSP 和PST 對(duì)3 齡東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，PSA、PSD 和PSF 僅具有微弱的殺蟲(chóng)活性，而PSE 則無(wú)明顯殺蟲(chóng)活性。對(duì)3 種疑似靶標(biāo)酶酶活影響的測(cè)定結(jié)果表明，6 個(gè)杠柳新苷類(lèi)化合物對(duì)東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV中的氨肽酶和堿性磷酸酶均無(wú)顯著作用；而對(duì)于V-ATP 酶，只有高殺蟲(chóng)活性的PSP 和PST 對(duì)其酶活有顯著的抑制，且具有明顯的濃度依賴(lài)性，其余化合物對(duì)V-ATP 酶的活性在測(cè)定濃度內(nèi)均無(wú)顯著影響；同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照藥劑Bafilomycin A1 與杠柳新苷類(lèi)化合物的聯(lián)合用藥進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果?；诖耍狙芯空J(rèn)為氨肽酶和堿性磷酸酶不是杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物在東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸的作用靶標(biāo)，而其活性位點(diǎn)可能存在于V-ATP酶上。

V-ATP 酶，又稱(chēng)為液泡 (vacuolar) ATP 酶，最早是由Anraku 與其同事于1981 年首次在酵母細(xì)胞的液泡膜上發(fā)現(xiàn)的一種傳輸質(zhì)子的ATP 酶[26]。此后，在各種動(dòng)植物和真菌中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了V-ATP酶的存在[27]。目前，發(fā)現(xiàn)V-ATP 酶廣泛存在于細(xì)胞原生質(zhì)膜和各種細(xì)胞器內(nèi)膜系統(tǒng)，如溶酶體、內(nèi)膜體、高爾基體和分泌顆粒等[28]。V-ATP 酶水解ATP，產(chǎn)生的能量維持質(zhì)子 (H+) 轉(zhuǎn)運(yùn)，從而建立跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度，實(shí)現(xiàn)膜內(nèi)外pH 值調(diào)節(jié)，酸化細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，為后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)吞、外泌和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生理生化反應(yīng)提供了必需條件[29]。最近對(duì)植物殺蟲(chóng)劑苦皮藤素的相關(guān)研究表明，VATP 酶H 亞基可能為苦皮藤素在昆蟲(chóng)體內(nèi)的一個(gè)作用靶標(biāo)，并由此提出一個(gè)苦皮藤素作用于VATP 酶的假說(shuō)，即苦皮藤素等活性化合物與VATP 酶H 亞基上的某些氨基酸相互結(jié)合，從而抑制了V-ATP 酶全酶形態(tài)的形成，進(jìn)而影響其活性，使其不能發(fā)揮正常作用[7]。理論上，如果活性化合物可與V-ATP 酶的某個(gè)亞基結(jié)合，但若不能抑制全酶的活力，則不能對(duì)其功能產(chǎn)生影響，對(duì)昆蟲(chóng)也就無(wú)任何作用。因此，對(duì)于酶學(xué)研究而言，首先應(yīng)明確活性化合物是否對(duì)全酶活性產(chǎn)生了影響，再進(jìn)而研究其具體的作用機(jī)理。本研究結(jié)果表明，杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物可顯著抑制東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 中V-ATP 酶的活性。定量差異蛋白組學(xué)研究表明，東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物后，其中腸細(xì)胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)[17]。蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cry1Ac 毒素處理的煙芽夜蛾 Heliothis virescens 幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基表現(xiàn)出上調(diào)，推測(cè)毒素與A 亞基結(jié)合可干擾H+/K+的正常轉(zhuǎn)運(yùn)，破壞了離子平衡及pH 值的穩(wěn)定性，認(rèn)為V-ATP 酶A 亞基為Cry1Ac 毒素在煙芽天蛾中腸的一個(gè)特異結(jié)合蛋白[30]。同樣，蛋白組學(xué)研究表明，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera 幼蟲(chóng)經(jīng)Bt 處理后，其中腸細(xì)胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基也表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)，推測(cè)昆蟲(chóng)體內(nèi)需要大量的能量用于應(yīng)對(duì)毒素壓力，而A 亞基的大量表達(dá)正是用于更多能量的提供[31]。本研究中杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物引起東方黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞BBMV 中的VATP 酶A 亞基上調(diào)表達(dá)的原因可能與上述研究推測(cè)相似，即昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)在取食活性化合物后，為應(yīng)對(duì)這外源物脅迫壓力，昆蟲(chóng)中腸需要消耗更多的能量，導(dǎo)致昆蟲(chóng)中腸內(nèi)的V-ATP 酶A 亞基的數(shù)量大量增加。但是，對(duì)于昆蟲(chóng)體內(nèi)V-ATP 酶全酶活性而言，導(dǎo)致其被抑制的因素有很多，如溫度、pH 環(huán)境，或者亞基之間的組裝過(guò)程，復(fù)合體V0與V1之間的裝配過(guò)程等等，與單亞基本身數(shù)量的多少并沒(méi)有必然聯(lián)系[32]?；诖耍P者推測(cè)杠柳新苷類(lèi)活性化合物可能與V-ATP 酶A 亞基相互結(jié)合后改變了A 亞基的正常構(gòu)型，使V0和V1復(fù)合體不能正常解離和裝配，進(jìn)而造成V-ATP酶全酶構(gòu)型發(fā)生改變，致使全酶活性降低或者喪失。

鑒于杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物對(duì)氨肽酶和堿性磷酸酶的活性無(wú)影響，卻顯著抑制了VATP 酶的活性，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性，結(jié)合定量差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果，筆者認(rèn)為杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物的初始作用位點(diǎn)位于VATP 酶A 亞基上。此發(fā)現(xiàn)對(duì)研究杠柳新苷類(lèi)殺蟲(chóng)活性化合物的具體作用機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證其特異靶標(biāo)位點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。