王占娣, 張 啦, 丁百蓮, 史云東, 王雅妮, 魯廣秋, 賈 琳*,

(1. 玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2. 遼寧金品生物科技有限公司，沈陽 110179)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella L. 又名小青蟲，鱗翅目菜蛾科昆蟲，以幼蟲取食植物葉肉、嫩莖、幼莢和籽粒為害，其寄主范圍廣，包括十字花科、茄科、百合科、甘藍(lán)和姜科等植物40 余種，其中，十字花科植物是小菜蛾主要寄主[1]。在世界范圍內(nèi)只要有十字花科植物種植的地區(qū)都有小菜蛾發(fā)生，因此，小菜蛾被稱為世界分布最為廣泛、蔬菜上最難防治且具毀滅性的鱗翅目類農(nóng)業(yè)害蟲[2]。在中國，小菜蛾遍布所有省份，發(fā)生面積高達(dá)213.33 萬公頃[3]。北方地區(qū)一般從5 月中旬一直持續(xù)到10 月下旬。在熱帶和亞熱帶地區(qū)周年發(fā)生，特別是在云南地區(qū)，由于其特殊的氣候條件和蔬菜種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，小菜蛾常年處于高峰期，且發(fā)生規(guī)律呈多樣化[4]。目前，小菜蛾的防治技術(shù)主要包括化學(xué)防治、生物防治和生態(tài)調(diào)控，其中化學(xué)防治是防治小菜蛾的主要手段，但由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，小菜蛾對(duì)90%以上的化學(xué)農(nóng)藥已產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性[1]。生物防治主要是利用寄生蜂、天敵和微生物等控制小菜蛾數(shù)量[5]，雖然生物防治在小菜蛾種群數(shù)量控制具有較大的優(yōu)勢，但由于小菜蛾發(fā)生時(shí)期與以上生物發(fā)生時(shí)期存在時(shí)間差異，導(dǎo)致小菜蛾前期防治效果不明顯。害蟲生態(tài)調(diào)控是利用多作物和非作物生境的設(shè)計(jì)與布局[6]，通過改變昆蟲食物網(wǎng)組成結(jié)構(gòu)調(diào)控害蟲種群。研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾對(duì)單一寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)具有明確的行為反應(yīng)，而在多寄主植物共存時(shí)，小菜蛾對(duì)不同寄主植物的行為反應(yīng)差異不明顯[7]。然而隨著產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，單一作物大面積種植結(jié)構(gòu)逐漸增加，不利于害蟲生態(tài)調(diào)控，迫切需要尋找新型、高效、不易產(chǎn)生抗性、對(duì)環(huán)境友好的綠色防治技術(shù)和產(chǎn)品。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，植物中的次生代謝物質(zhì)能夠調(diào)控植食性昆蟲的行為，干擾植食性昆蟲對(duì)植物作出的取食和產(chǎn)卵的定向/識(shí)別行為[8-11]。如郭明程等[12]研究發(fā)現(xiàn)，爵床甲醇提取物能干擾小菜蛾產(chǎn)卵行為；Keesey 等[13]報(bào)道，獼猴桃提取物對(duì)果蠅具有產(chǎn)卵趨避作用。王志宇等[14]報(bào)道，機(jī)械損傷后的薄荷對(duì)小菜蛾具有較強(qiáng)的驅(qū)避活性。在小菜蛾寄主植物，特別是十字花科蔬菜中，普遍存在有引誘小菜蛾取食和產(chǎn)卵的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)能有效控制害蟲的發(fā)生及危害，可用于綠色防控產(chǎn)品的開發(fā)。但不同蔬菜品種所含的活性物質(zhì)存在差異，如Reddy 等[15]報(bào)道，結(jié)球甘藍(lán)中含有6 個(gè)碳原子數(shù)的醇類或酯類，如1-己醇、1-己烯-3-醇、己醛、(E)-2-己醛、醋酸己酯、乙酸順-3-己烯酯 (綠葉氣體) 和 (Z)-3-醋酸己烯酯。韓寶瑜等[16]報(bào)道，白菜中含有烯丙基異硫氰酸酯、碳原子數(shù)在6～24 的烯烴類、酯類、醇類和綠葉氣體等。

小白菜Brassica campestrs L. ssp. Chinensis var. communis 為十字花科蕓薹屬小白菜亞種蔬菜，具有生長周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。在中國各地均有種植，其中，在長江中下游地區(qū)小白菜的種植面積可達(dá)30%～40%，在云南地區(qū)終年種植，年產(chǎn)量可達(dá)上萬噸[17]。目前，小白菜是小菜蛾的主要寄主之一，表明在小白菜的次生代謝物質(zhì)中存在能夠使小菜蛾準(zhǔn)確尋找和定位的活性物質(zhì)，但至今未見有關(guān)小白菜中調(diào)節(jié)小菜蛾成蟲行為的活性物質(zhì)的報(bào)道。因此，本研究采用不同極性溶劑提取小白菜中次生代謝物質(zhì)，評(píng)價(jià)這些物質(zhì)對(duì)小菜蛾雌蟲行為的調(diào)節(jié)作用，并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，探討小白菜次生代謝物質(zhì)對(duì)小菜蛾行為的調(diào)節(jié)作用，尋找防治小菜蛾的先導(dǎo)化合物，旨在為小菜蛾的綠色防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑及藥劑

石油醚 (60%～90%) 和乙酸乙酯 (純度99.5%)，西隴科學(xué)股份有限公司；二氯甲烷 (純度99.5%)，國際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 (純度99.7%) 重慶川東化工集團(tuán)有限公司；二次蒸餾水。

1.2 主要儀器

YC-SXT-06 六聯(lián)脂肪儀，上海鄆曹電子有限公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SQ8T 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國PerlinEler；QC-1B 大氣采樣儀，北京勞保所。

1.3 供試?yán)ハx

小菜蛾P(guān)lutella xylostella L. 幼蟲采集于云南省玉溪市江川區(qū)的芥藍(lán)田，在幼蟲時(shí)期區(qū)分出其性別后，將雌、雄蟲分別置于不同的盒子內(nèi)，于室內(nèi)用芥藍(lán)苗培養(yǎng)至孵化出小菜蛾成蟲。室內(nèi)環(huán)境條件：溫度 (27 ± 1) ℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光周期為L : D = 12 h : 12 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 提取液的制備 稱取10 g 小白菜，利用六聯(lián)脂肪提取器，依次加入100 mL 不同極性溶劑 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇和石油醚)進(jìn)行提取，提取時(shí)間以提取器內(nèi)溶液顏色變淡為止。收集提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL。將濃縮液稀釋至最終質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125 g/mL，于4 ℃下保存，備用。

1.4.2 提取液中化學(xué)成分的鑒定 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 鑒定提取液中化學(xué)成分。檢測條件如下。

GC：進(jìn)樣量1.0 μL；分流比20 : 1；進(jìn)樣溫度250 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升溫至260 ℃，保持10 min。

MS：傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描線：Tic(全掃描)；柱子：Ei 比-5MS(30 mm ×0.25 mm × 0.25 mm)；離子源70 eV；掃描時(shí)間和GC 時(shí)間一致，掃描范圍m/z 33～550。

1.4.3 行為評(píng)價(jià) 取兩個(gè)直徑為0.8 cm 的濾紙片，分別滴加100 μL 質(zhì)量濃度為0.5、0.25 和0.125 g/mL 的小白菜提取液。以等量的溶劑作對(duì)照 (CK)。自然晾干。將濾紙片分別置于Y 型管的兩個(gè)支管中，主管引入20 頭未交配的小菜蛾雌蟲，風(fēng)速控制在3～5 cm/min，設(shè)4 次重復(fù)，30 min后記錄各支管中小菜蛾的數(shù)量。按 (1) 式計(jì)算小菜蛾的反應(yīng)率。

R：反應(yīng)率；NTr：處理組蟲量；NCK：對(duì)照組蟲量。

1.4.4 田間誘捕雌蟲試驗(yàn) 試驗(yàn)安排在玉溪師范學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)，面積22 m2，種植蔬菜為甘藍(lán)。將小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液均配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，作為供試液。取200 μL 供試液滴加到橡膠芯中作為處理。分別以等量的蒸餾水和無水乙醇作為對(duì)照。將橡膠芯懸掛于自制的簡易誘捕器中。按照隨機(jī)分組的方式，將誘捕器放在甘藍(lán)田的不同位置，誘捕器局距離地面的高度為20 cm，3 d 后記錄誘捕器內(nèi)小菜蛾雌蟲的數(shù)量。每處理2 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 8.0 軟件進(jìn)行分析，采用x2分析處理組與CK 組之間的差異性 (α = 0.05)；采用非均衡資料ANOVA 統(tǒng)計(jì)相同溶劑不同濃度提取液對(duì)小菜蛾雌蟲行為調(diào)節(jié)作用 (α = 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白菜提取液對(duì)小菜蛾雌蟲行為的調(diào)節(jié)作用

2.1.1 小白菜不同極性提取液對(duì)小菜蛾雌蟲行為的調(diào)節(jié)作用 分別以石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷為溶劑提取小白菜，用得到的提取液處理小菜蛾雌蟲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組成蟲數(shù)量隨著提取液濃度的增加而降低。當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.5 g/mL時(shí)，小白菜的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取液組成蟲數(shù)量明顯高于CK 組；當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.25 g/mL 時(shí)，只有小白菜的二氯甲烷提取液組成蟲數(shù)量明顯高于CK 組 (圖1A、1B、1C)。而采用無水乙醇和蒸餾水提取小白菜時(shí)，其提取物組的成蟲數(shù)量隨著測試濃度的增加而增加，當(dāng)其質(zhì)量濃度分別為0.25g/mL 和0.125 g/mL 時(shí)，無水乙醇和蒸餾水提取液組的成蟲數(shù)量明顯高于CK(圖1D、1E)。結(jié)果表明，5 種不同溶劑提取物對(duì)小菜蛾雌蟲行為均具有調(diào)節(jié)作用，其中低極性物質(zhì)在高濃度時(shí)及高極性物質(zhì)在低濃度時(shí)對(duì)雌蟲具有引誘效果。

2.1.2 小白菜不同極性溶劑提取物調(diào)控小菜蛾雌蟲行為的比較 當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在0.25～0.50 g/mL范圍內(nèi)時(shí)，小白菜無水乙醇提取液處理組小菜蛾雌蟲數(shù)量與蒸餾水提取液處理組的差異不顯著。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.125 g/mL 時(shí)，蒸餾水提取液組小菜蛾雌蟲數(shù)量明顯高于無水乙醇提取液處理組(圖2)。表明蒸餾水提取液對(duì)小菜蛾的引誘效果優(yōu)于無水乙醇提取液。

2.2 田間誘捕效果

使用簡易誘捕器，以小白菜提取液為誘捕劑，田間誘捕3 d 后調(diào)查誘捕器內(nèi)小菜蛾雌蟲數(shù)量。結(jié)果(圖3)顯示，溶劑對(duì)照誘捕到的蟲口數(shù)量明顯低于小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液，其中，蒸餾水提取液誘捕到的雌蟲數(shù)量最多，明顯多于無水乙醇提取液。表明小白菜蒸餾水中含有引誘小菜蛾的潛在活性物質(zhì)。

2.3 提取液活性成分的分析

小白菜不同極性溶劑提取液總離子流色譜圖見圖4。結(jié)合NIST2012、WILEY 譜圖庫和文獻(xiàn)報(bào)道，確定小白菜提取液的化學(xué)成分。結(jié)果(表1)顯示，小白菜不同溶劑提取液中的主要成分為酯類、烷烴類、酮類、醇類、酸類、醛類和酰胺類。其中，二氯甲烷提取液中的主要成分為烷烴

類，乙酸乙酯提取液中的主要成分為酯類和少量的酰胺類；無水乙醇提取液中成分為醇類和酸類，分別為 Z -2-(9-十八烷烯氧基) 乙醇、9,12,15-十八碳三烯酸、棕櫚酸、3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇和8,11,14-二十碳三烯酸。小白菜蒸餾水提取液中的主要成分為異戊膽酸乙酯和9,12,15-十八碳三烯醛，其中異戊膽酸乙酯含量最高 。

表1 小白菜不同極性溶劑提取液主要化學(xué)成分Table1 The main chemical components of extraction from pakchoi with different polar solvents

3 結(jié)論與討論

綠色防治技術(shù)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)害蟲防治研究的熱點(diǎn)，從植物次生代謝物質(zhì)中篩選基于揮發(fā)物的化學(xué)生態(tài)調(diào)控技術(shù)是綠色防治技術(shù)研究的主要途徑。一般采用有溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、頂空收集法和固相微萃取技術(shù)從植物中獲得調(diào)控昆蟲行為的次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)主要為相對(duì)分子質(zhì)量在100～200 之間的醇類、醛類、酮類、酸類、酚類、乙炔類、含氮化合物、有機(jī)酸、萜烯類和芳香類揮發(fā)性物質(zhì)[15-17]。如采用頂空收集法[15]和頂空固相微萃取法[18]從白菜中鑒定的化合物有2,5-乙二醇、反-2-己烯-1-醇、芳樟醇、香葉醇、反-4-己烯-1-醇、異硫氰酸酯類物質(zhì)和硫代葡萄糖苷等。本研究采用熱回流浸提法，利用5 種不同極性溶劑提取小白菜，對(duì)不同溶劑提取液進(jìn)行成分分析發(fā)現(xiàn)，小白菜中的化合物主要為酯類、烷烴類、酮類、醇類、酸類、醛類、酰胺類和少量的酸類，這與采用頂空收集法和頂空固相萃取法提取的化合物種類相同。對(duì)強(qiáng)極性溶劑 (無水乙醇和蒸餾水) 提取液中的化合物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些化合物的碳原子數(shù)在16～18 之間，相對(duì)分子質(zhì)量在256～312 之間，碳原子數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量均高于采用頂空收集法和固相微萃取技術(shù)得到的化合物。出現(xiàn)這種差異的原因可能為頂空收集法和頂空固相萃取法提取的物質(zhì)為植物釋放低揮發(fā)性物質(zhì)，而采用熱回流浸提法得到的物質(zhì)主要為揮發(fā)性成分。

文獻(xiàn)報(bào)道，寄主植物中釋放的次生代謝物質(zhì)對(duì)昆蟲取食、交配和產(chǎn)卵行為具有調(diào)節(jié)作用[19]。如Gerofotis 等[20]報(bào)道，橄欖果實(shí)和葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)有利于橄欖果蠅的交配。甘藍(lán)受機(jī)械損傷或蟲害后釋放的低揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)小菜蛾具有引誘效果[21]，番茄釋放的揮發(fā)物能誘導(dǎo)美洲棉鈴蟲雌蟲產(chǎn)卵[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，小白菜5 種不同極性溶劑 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水) 提取液對(duì)小菜蛾雌蟲具有明顯的引誘效果，其中，無水乙醇和蒸餾水提取液的引誘效果明顯高于其他處理。對(duì)這兩種提取液的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在兩種提取液中含有具有相同母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，即9,12,15-十八碳三烯醛 (小白菜蒸餾水提取液) 和9,12,15-十八碳三烯酸 (小白菜無水乙醇提取液)。文獻(xiàn)報(bào)道碳鏈長度為10～18 的醛是鱗翅目昆蟲信息素的活性成分[23]，如9,12,15-十八碳三烯醛是美國白蛾性信息素的主要成分[24]。9,12,15-十八碳三烯酸又稱為亞麻酸，是植物揮發(fā)性物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[25]。棕櫚酸乙酯對(duì)棗實(shí)蠅具有明顯的引誘效果[26]，棕櫚酸對(duì)薇甘菊頸盲蝽具有明顯的引誘效果[27]，同時(shí)這兩個(gè)化合物還是異遲眼蕈蚊性信息素主要成分[28]，但尚未見棕櫚酸、棕櫚酸乙酯和其他成分對(duì)鱗翅目昆蟲具有行為調(diào)節(jié)作用的報(bào)道。小白菜蒸餾水提取液中含量最高的化合物為異戊膽酸乙酯，該化合物為甾醇類物質(zhì)，具有揮發(fā)性[29]，但未見其對(duì)昆蟲行為具有調(diào)節(jié)作用的報(bào)道。由此推測，9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液調(diào)節(jié)小菜蛾雌蟲行為的活性物質(zhì)，其中，前者的分子質(zhì)量 (262 Da) 小于后者(分子質(zhì)量為278 Da)，揮發(fā)性前者強(qiáng)于后者，這可能是小白菜水提液對(duì)小菜蛾雌蟲的引誘活性高于小白菜乙醇提取液的原因之一。9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是否是小菜蛾性信息素，其對(duì)小菜蛾雌蟲行為調(diào)節(jié)方式是交配還是產(chǎn)卵引誘，以及異戊膽酸乙酯對(duì)小菜蛾是否具有行為調(diào)節(jié)活性等，還需進(jìn)一步研究。

本文基于綠色防治技術(shù)，從小菜蛾寄主植物之一的小白菜中鑒定出對(duì)小菜蛾雌蟲具有引誘效果的物質(zhì)，首次在小白菜中發(fā)現(xiàn)了9,12,15-十八碳三烯醛具有引誘小菜蛾雌蟲的潛在活性，可用于小菜蛾綠色防控產(chǎn)品的開發(fā)。