馮煒業(yè) 柯璐琳

慢性膽囊炎為相當(dāng)常見的消化系統(tǒng)疾病，多由膽結(jié)石所致膽囊壁炎癥，或膽汁瘀積、感染導(dǎo)致急性膽囊炎反復(fù)發(fā)作拖延不愈而致[1]。這幾年，中醫(yī)藥在醫(yī)治慢性膽囊炎上發(fā)揮了重要作用，在一定程度上補(bǔ)充了西藥治療療效不佳的情況。

膽舒膠囊中主要活性成分為薄荷素油，其為新鮮的唇形科薄荷的莖和葉經(jīng)一系列加工獲得的揮發(fā)油。薄荷是傳統(tǒng)的食藥兩用植物，具有抑菌、抗炎、止痛、抗癌、解痙等生物活性，臨床上可將其為單方或復(fù)方治療慢性膽囊炎，但在薄荷治療慢性膽囊炎的分子機(jī)制上的研究報(bào)道甚少。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出膽舒膠囊中君藥薄荷的主要有效活性成分和發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，探究慢性膽囊炎的已知疾病靶點(diǎn)，分別繪制PPI及“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行分析；依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用R語(yǔ)言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包對(duì)靶點(diǎn)基因本體(GO)的生物進(jìn)程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞成分(CC)3個(gè)水平及KEGG信號(hào)通路進(jìn)行分析，為膽舒膠囊治療慢性膽囊炎分子機(jī)制的進(jìn)一步探索提供參考。

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)分析平臺(tái)；Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)；Swiss target predict數(shù)據(jù)庫(kù)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)；String數(shù)據(jù)庫(kù)； Venny 2.1.0軟件； Cytoscape 3.7.2軟件；Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)；R語(yǔ)言軟件；clusterProfiler等數(shù)據(jù)包等。

2 方法

2.1 主要活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選基于TCMSP平臺(tái)，“薄荷”為關(guān)鍵詞，選擇口服生物利用度(OB)≥30%并且類藥特性(DL)≥0.18作為篩選條件[2]，同時(shí)結(jié)合楊倩[3]的報(bào)道，獲得相關(guān)的化合物成分。將篩選后的化學(xué)成分導(dǎo)入Pubchem服務(wù)器，得到化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)的SDF文件。最后，運(yùn)用Swiss target predict數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入化學(xué)成分的SDF文件，選擇物種為“智人”，選擇Probability值>0的靶點(diǎn)，剔除未獲得靶點(diǎn)的成分，剔除重復(fù)靶點(diǎn)，獲取活性成分靶基因，并經(jīng)過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行注釋。

2.2 疾病靶點(diǎn)的收集分別在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、以“chronic cholecystitis”為關(guān)鍵詞，搜集與慢性膽囊炎發(fā)病的相關(guān)靶基因，合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)疾病靶點(diǎn)，剔除重復(fù)值，獲得慢性膽囊炎疾病靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的繪制與分析運(yùn)用 Venny 2.1.0軟件將薄荷活性成分靶點(diǎn)與慢性膽囊炎疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎的治療靶點(diǎn)。將獲得的治療靶點(diǎn)上傳String在線數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的核心基因進(jìn)行分析。

2.4 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將薄荷、有效活性成分、交集治療靶點(diǎn)、疾病間相互關(guān)系導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 GO與KEGG富集分析依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)，R語(yǔ)言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包對(duì)膽舒膠囊治療靶點(diǎn)的生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞成分3個(gè)水平進(jìn)行GO富集分析；同樣方法進(jìn)行KEGG富集分析，R語(yǔ)言繪制KEGG信號(hào)通路富集分析高級(jí)氣泡圖，以揭示膽舒膠囊治療慢性膽囊炎的分子機(jī)制。

3 結(jié)果

3.1 藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的確定TSMCP平臺(tái)檢索得到薄荷化學(xué)成分有164個(gè)，符合篩選條件的化學(xué)成分10個(gè)，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、蘆薈大黃素、圣草酚、芫花素、木犀草素；結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道薄荷揮發(fā)油含量高的4個(gè)活性成分，分別是L-薄荷酮、胡椒酮、L-薄荷醇、胡薄荷酮；在Swiss target predict數(shù)據(jù)庫(kù)剔除未獲得成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的蘆薈大黃素以及未與疾病靶點(diǎn)獲得交集的胡薄荷酮，篩選出薄荷化學(xué)成分12個(gè)，薄荷作用靶點(diǎn)270個(gè)，見表1。經(jīng)過GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，整合獲得慢性膽囊炎疾病靶點(diǎn)502個(gè)，運(yùn)用Venny 2.1.0軟件取薄荷與慢性膽囊炎疾病靶點(diǎn)交集，見圖1。得到治療靶點(diǎn)36個(gè)，見表2。

表1 薄荷關(guān)鍵化合物

圖1 韋恩圖

表2 薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)將治療靶點(diǎn)上傳String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“智人”，選擇medium confidence(0.400)，隱藏離散點(diǎn)，得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中節(jié)點(diǎn)代表治療靶點(diǎn)，“邊”代表治療靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)，其粗細(xì)用結(jié)合分?jǐn)?shù)表示，“邊”越粗結(jié)合分?jǐn)?shù)值越大，代表其結(jié)合度越大。由R語(yǔ)言軟件繪制出節(jié)點(diǎn)數(shù)排名前20的核心基因條形圖，橫坐標(biāo)為節(jié)點(diǎn)數(shù)，縱坐標(biāo)為基因symbol。見圖3。

圖2 薄荷靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白互作核心基因柱狀圖

3.3 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建薄荷治療慢性膽囊炎的藥物-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從而間接體現(xiàn)了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。見圖4。

圖4 薄荷-有效活性成分-交集治療靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 GO富集分析采用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因symbol進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用R語(yǔ)言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包，設(shè)置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05，從生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞成分3個(gè)水平對(duì)36個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分類富集分析，GO富集結(jié)果包括細(xì)胞對(duì)氧化的應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、正向調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖、膠原代謝過程等生物進(jìn)程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、肥大細(xì)胞顆粒等細(xì)胞成分。

3.5 KEGG富集分析利用上述的基因ID，同樣依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)，利用R語(yǔ)言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包，設(shè)置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，包括癌癥通路、TNF信號(hào)通路、Relaxin信號(hào)通路、磷酸酯酶D信號(hào)通路、VGEF信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路等代謝通路。取排名前20的KEGG信號(hào)通路繪制高級(jí)氣泡圖。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析高級(jí)氣泡圖

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)藥物治療疾病的靶點(diǎn)、通路等可以從分子水平上預(yù)測(cè)，故本文通過該策略研討膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎的分子機(jī)制，結(jié)果獲得12個(gè)主要活性成分，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、圣草酚、芫花素、木犀草素、L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)金合歡素具備多重生物活性，如抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等效用[4]。蒙花苷可以通過調(diào)節(jié)炎性因子與炎性介質(zhì)的水平而產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]。谷甾醇的抗炎機(jī)制可能是通過抑制炎癥介質(zhì)PGE2、緩激肽、組胺、5-HT等的活性來(lái)抑制游離細(xì)胞的遷移[6]。豆甾醇和圣草酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等藥理活性。L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮為薄荷揮發(fā)油中含量高的主要成分，它們可通過干預(yù)消化道鈣離子的跨膜運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生解痙、使消化道平滑肌松弛，形成利膽作用[7]。周露[8]的研究表明薄荷揮發(fā)油具有顯著的抗大腸埃希氏菌、嗜肉菌、白假絲酵母菌等菌株活性。

藥物與疾病的交集靶點(diǎn)36個(gè)，包括VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9、MMP2、MPO、HIF1A等，主要涉及血管生成、炎癥反應(yīng)、癌癥進(jìn)展、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等生理病理進(jìn)程。在VEGFRA-VEGFR2信號(hào)蛋白通路中，PI3K下游信號(hào)的AKT激活后，通過下游的Bad、mTORC1、FOXO、GSK-3β、eNOS等靶分子調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和血管通透性、參與血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的炎癥反應(yīng)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是影響局部上皮組織新生血管修復(fù)和內(nèi)皮細(xì)胞形成的重要因素，其可以參與癌癥、炎癥、免疫疾病的進(jìn)展。EGFR是EGF與TGF-α受體；同時(shí)，相關(guān)研究表明，EGFR可導(dǎo)致膽固醇核化過程異常，促使膽結(jié)石的形成[9]。因此，我們推測(cè)，薄荷中的有效活性成分可與EGFR相互作用，阻斷促炎因子與EGFR結(jié)合，起到抗炎作用，同時(shí)抑制膽結(jié)石的形成。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一類可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子，可由多種細(xì)胞分泌表達(dá)，其生物學(xué)功能主要包括細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等。TNF-α細(xì)胞因子處于家族中最重要的地位，主要通過對(duì)MAPK、NF-κB、ERK等信號(hào)通路的上調(diào)，起誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促炎作用[10]。MAPK靶點(diǎn)同樣與腫瘤、炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)[11]，磷酸化的p38MAPK可激活許多底物如轉(zhuǎn)錄因子、胞漿與胞核內(nèi)蛋白、蛋白激酶等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的分化、周期停滯、衰老、凋亡、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和RNA剪接的調(diào)控等，且這種活化作用通常具有組織細(xì)胞特異性。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS2)作為環(huán)氧酶途徑中的雙功能酶，作為前列腺素中氧化酶的還原酶，具備COX與過氧化酶活性，可將花生四烯酸催化成前列腺素，推測(cè)薄荷活性成分可能通過抑制PTGS2以達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)痛效果。MMPs是肽鏈內(nèi)切酶，它能夠降解細(xì)胞外基(ECM)的組成成分，MMP9、MMP2可促成腫瘤新生血管的形成，導(dǎo)致血管局部基底膜降解，創(chuàng)造促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[12]。髓系細(xì)胞中的髓過氧化物酶(MPO)遇到病原體后，骨髓細(xì)胞可以產(chǎn)生過量的H2O2，MPO與H2O2等氧化劑發(fā)生過氧化反應(yīng)和正鹵化反應(yīng)，產(chǎn)生殺菌能力很強(qiáng)的次氯酸(HClO)，可引起蛋白質(zhì)破裂、DNA變性和氨基酸分解等病理過程[13]。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)作為一種由機(jī)體在缺氧時(shí)產(chǎn)生的依賴氧的轉(zhuǎn)錄激活物,誘導(dǎo)VEGF、促炎黏附分子和趨化因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境。

經(jīng)過GO及KEGG富集結(jié)果分析可知，GO富集分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、金屬離子的響應(yīng)、正向調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖、膠原代謝過程等生物進(jìn)程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、肥大細(xì)胞顆粒等細(xì)胞成分。KEGG富集分析提示膽舒膠囊主要是通過癌癥、TNF、Relaxin、磷酸酯酶D、VEGF、HIF-1等信號(hào)通路發(fā)揮協(xié)同作用。HIF-1通路水平的變化與AKT，NF-κB通路有關(guān)，還可誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄，為干預(yù)炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凋亡、腫瘤的重要信號(hào)通路[14]。薄荷活性成分可通過Relaxin信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用：relaxin-2可以抑制 TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[15]。

綜上所述，本文初次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的策略研究膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎分子機(jī)制，提示其可能通過抗炎鎮(zhèn)痛、解痙、利膽、抗菌等方面來(lái)治療慢性膽囊炎；成功地預(yù)測(cè)了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎主要作用的靶點(diǎn)與相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)膽舒膠囊經(jīng)過多組分-多靶點(diǎn)-多通路發(fā)揮醫(yī)治作用，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究等提供參考。