鄒勇

摘要：目的：研究長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中的表達(dá)水平。方法：使用qRT-PCR檢測15例急性白血病和15例缺鐵性貧血患者的長鏈非編碼RNA CARLo 5的表達(dá)差異。結(jié)果：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病與缺鐵性貧血患者中的表達(dá)存在差異。對(duì)比缺鐵性貧血對(duì)照組，長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對(duì)照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121 （ P<0.001）。 結(jié)論：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中呈過表達(dá)狀態(tài)，可以作為急性髓性白血病的生物學(xué)標(biāo)記。長鏈非編碼RNA CARLo 5有可能成為治療急性髓性白血病的藥物靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA，生物學(xué)標(biāo)記，急性髓性白血病。

【中圖分類號(hào)】R733.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）02-010-02

急性髓性白血?。ˋML）是較常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，目前，化療仍然是白血病治療中最重要和最基本的治療方法和手段，但是由于缺乏標(biāo)靶的選擇性，在殺死腫瘤細(xì)胞時(shí)也會(huì)無選擇性的損傷正常的造血組織和細(xì)胞，往往在治療過程中產(chǎn)生比較大的副反應(yīng)。能夠僅殺傷白血病細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無傷害的精準(zhǔn)治療是我們夢想的治療方式，這就需要我們能找到白血病分子和正常分子之間的差異，針對(duì)差異去設(shè)計(jì)精準(zhǔn)治療方案。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。這類RNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能，無人關(guān)注，被塵封了起來。lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[1-3]。而隨著高通量測序技術(shù)、大規(guī)模 LncRNA、 cDNA 文庫的建立 、基因芯片技術(shù)的高速發(fā)展，LncRNA被發(fā)現(xiàn)與生物進(jìn)化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝以及人類多種重大疾病關(guān)系密切，包括腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵問題[4-7]。目前，LncRNA已經(jīng)成為了腫瘤研究的前沿和熱點(diǎn)。

LncRNA CARLo 5（cancer-associated region long noncoding RNAs 5），是一種最近確認(rèn)的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認(rèn)為在細(xì)胞周期和腸道腫瘤發(fā)展中有重要作用。LncRNA CARLo 5在腫瘤中發(fā)生，發(fā)展中有重要的意義，但LncRNA CARLo 5具體的作用機(jī)制及下游靶分子的研究尚不清楚，而且在白血病可中尚未見有LncRNA CARLo 5相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

材料和方法

1.病例資料

收集 2016年 5 月-2018 年 5 月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科確診 15 例初診的 AML 患者為研究對(duì)象（ AML 組），同期選擇性別與年齡相符，且符合缺鐵性貧血（ iron- deficiency anemia，IDA） 國際標(biāo)準(zhǔn)的 IDA 患者15 例作為對(duì)照組（ Control） 。所有入組者所留取的標(biāo)本均為骨髓，所有入選者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.主要的試劑及儀器

RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司; 總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Thermofisher公司;熒光定量PCR（qRT-PCR）SYBR-Green 試劑盒購自日本 Takara 公司; 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ GAPDH） 和LncRNA CARLo 5 上下游引物購自上海生工生物工程股份有限公司，7500 熒光定量 PCR 儀：美國ABI 公司。

3.樣本收集、RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用 EDTA抗凝管收集對(duì)照組、 AML組患者骨髓液 2 ml，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后1 500 R / min 離心 5min，棄上清液后加入 1 ml TRizol充分吹打細(xì)胞沉淀，移至 1.5 ml EP 管中，標(biāo)記保存于 -80 ℃。通過經(jīng)典吸附柱法，按照說明書所述，抽提留存的骨髓標(biāo)本中的總 RNA，紫外分光光度計(jì)檢測 RNA 濃度及純度。采用美國 Thermofisher 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按其說明書步驟配置反應(yīng)體系，在普通PCR 儀提前設(shè)置好的反應(yīng)條件下將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20℃ 保存。

4.引物設(shè)計(jì)與合成

在美國國立生物技術(shù)信息中心（ National Center for Biotechnology Information，NCBI） （ https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/） 查找 LncRNA CARLo 5、 GAPDH基因序列，由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成正反向引物，引物序列見表 1。

5.qRT-PCR

按照 SYBR Green試劑盒說明書操作，以 cDNA 為模板，反應(yīng)體系為 20 μl，加入反應(yīng)試劑進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系包括： 模板 cDNA 2 μl、SYBR 10 μl、GAPDH 或者 LncRNA CARLo 5 的正反向引物各 0.8 μl、加無菌蒸餾水至總反應(yīng)體積 20 μl。qPCR 反應(yīng)條件： 95 ℃ 、30s 預(yù)變性; 之后 95 ℃ 變性 5 s、60 ℃ 延伸 30 s，共計(jì)完成 45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè) 2 個(gè)復(fù)孔PCR擴(kuò)增結(jié)束后可獲取擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold CT）值，以 GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△CT法計(jì)算LncRNA CARLo 5在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用 t 檢驗(yàn)分析LncRNA CARLo 5表達(dá)量的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

LncRNA CARLo 5 在 AML 患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)情況

qRT-PCR 法檢測LncRNA CARLo 5 在 15 例初治 AML 患者和15 例IDA 患者中的表達(dá)。結(jié)果顯示，LncRNA CARLo 5 在 AML 患者中的表達(dá)量較IDA（ Control） 患者明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對(duì)照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖1。

討論

急性髓性白血病占據(jù)成人急性白血病的大部分，且多發(fā)于中老年人，因出現(xiàn)不耐受常規(guī)化療、無骨髓移植的情況，預(yù)后不佳，急待副作用較小的靶向治療。

Lnc RNA是一類長度大于 200 nts的RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)被廣泛被轉(zhuǎn)錄，曾被認(rèn)為不具備生物學(xué)功能。但目前研究認(rèn)為Lnc RNA具有非常重要的生物學(xué)功能，其雖然不翻譯，但也可以和蛋白分子一樣，作為調(diào)節(jié)分子參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、周期、分化、凋亡等各種生物學(xué)過程，也參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等各種病理過程。如LncRNA UCA1 通過調(diào)節(jié)CREB蛋白表達(dá)水平并激活 PI3K 信號(hào)通路參與膀胱癌細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)了腫瘤的生長，表明 lncRNA 與腫瘤異常信號(hào)通路有關(guān)[8] ;LncRNA CCAT1被c-myc基因激活促進(jìn)了胃癌的增殖和遷移[9]，而LncRNA-HEIH通過抑制 EZH2 靶基因提高了EZH2 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期 G0/G1 期阻滯。越來越多的文章表明，相對(duì)正常組織，LncRNA在惡性腫瘤中有明顯異常的表達(dá)，它可以作為很多腫瘤的分子標(biāo)記。

LncRNA CARLo 5是一種最近確認(rèn)的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認(rèn)為在細(xì)胞周期和腸道腫瘤發(fā)展中有重要作用。原癌基因MYC增強(qiáng)子的rs6983267 allet能與LncRNA CARLo 5的啟動(dòng)子的激活調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合并長期作用，從而影響LncRNA CARLo 5的表達(dá)，而增加腫瘤的易感性[10]。Luo J[11]認(rèn)為LncRNA CARLo 5是一個(gè)小細(xì)胞肺癌的陽性預(yù)后因子，和其致瘤性相關(guān)。而在肝癌研究的回顧性研究中，LncRNA CARLo 5也被認(rèn)為和疾病進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[12]。而在血液腫瘤中LncRNA CARLo 5的研究罕見報(bào)道。本研究表明，LncRNA CARLo 5 在AML 高表達(dá)，下一步可擴(kuò)大病例數(shù)驗(yàn)證上述結(jié)果，并研究LncRNA CARLo 5 的表達(dá)水平與 AML 患者總生存和預(yù)后的影響。同時(shí)在白血病細(xì)胞株中深入研究 LncRNA CARLo 5 在白血病中的作用及可能的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1].Cheng W，Zhang Z，Wang J.Long noncoding RNAs： new players in prostate cancer.Cancer Lett.2013;339：8–14.

[2].Huang JL，Zheng L，Hu YW，Wang Q.Characteristics of?long non-coding RNA and its relation to hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis.2014;35：507–14.

[3].Maass PG，Luft FC，Bahring S.Long non-coding RNA in health and disease.J Mol Med （Berl）.2014;92：337–46

[4].Fatica A，Bozzoni I.Long non-coding RNAs： new players in cell differentiation and develop- ment.Nat Rev Genet 2014; 15： 7-21.

[5].Ge XS，Ma HJ，Zheng XH，Ruan HL，Liao XY，Xue WQ，Chen YB，Zhang Y，Jia WH.HOTAIR，a prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma，inhibits WIF-1 expression and acti- vates Wnt pathway.Cancer Sci 2013; 104： 1675-1682.

[6].Huang JF，Guo YJ，Zhao CX，Yuan SX，Wang Y，Tang GN，Zhou WP，Sun SH.Hepatitis B virus X protein （HBx）-related long noncoding RNA （lncRNA） down-regulated expression by HBx （Dreh） inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin.Hepatology 2013; 57： 1882- 1892.

[7].Yang F，Zhang L，Huo XS，Yuan JH，Xu D，Yuan SX，Zhu N，Zhou WP，Yang GS，Wang YZ，Shang JL，Gao CF，Zhang FR，Wang F，Sun SH.Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in hu- mans.Hepatology 2011; 54： 1679-1689.

[8]Fan Y，Shen B，Tan M，et al.Long non-coding RNA UCA1 increases chemoresistance of bladder cancer cells by regulating Wnt signaling[J].Febs Journal，2014，281（7）：1750-8.

[9] Zhao W，Sun C，Cui Z.A long noncoding RNA UCA1 promotes proliferation and predicts poor prognosis in glioma[J].Clinical & Translational Oncology，2017：1-7

[10].Kim T，Cui R，Jeon YJ，Lee JH，Lee JH，Sim H，Park JK，F(xiàn)adda P，Tili E，Nakanishi H，Huh MI，Kim SH，Cho JH，Sung BH，Peng Y，Lee TJ，Luo Z，Sun HL，Wei H，Alder H，Oh JS，Shim KS，Ko SB，Croce CM.Long-range interaction and correlation between MYC enhancer and oncogen- ic long noncoding RNA CARLo 5.Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111： 4173-8.

[11].Luo J1，Tang L，Zhang J，Ni J，Zhang HP，Zhang L，Xu JF，Zheng D，Long non-coding RNA CARLo 5 is a negative prognostic factor and exhibits tumor pro-oncogenic activity in non-small cell lung cancer.Tumour Biol.2014 Nov;35（11）：11541-9.

[12].Wang F，Xie C，Zhao W，Deng Z，Yang H，F(xiàn)ang Q.Long non-coding RNA CARLo 5 expression is associated with disease progression and predicts outcome in hepatocellular carcinoma patients.Clin Exp Med.2015 [Epub ahead of print]

福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科?363000